摘要：【目的】着丝粒是真核生物染色体的基本功能元件之一,其功能是在细胞有丝分裂和减数分裂时期精确地调控染色体配对和分离并维持染色体的稳定。着丝粒结构是由DNA和蛋白质形成的一种复合体。着丝粒特异组蛋白(centromere-specific histone H3,CENH3)是功能着丝粒是否具有活性的最基本特征。所以制备CENH3的相关抗体是进行着丝粒结构与功能研究的前提条件之一。【方法】通过设计短肽进行兔免疫实验,制备了水稻着丝粒特异组蛋白CENH3兔源抗体,利用ELISA和蛋白免疫荧光(immunofluorescence,IF)等检测方法对抗体有效性进行了鉴定。【结果】ELISA检测显示制备的CENH3抗体有效稀释度为1:40万,并且蛋白免疫荧光信号在水稻体细胞每条染色体的着丝粒区域均能检测到。同时,该抗体也可以应用于玉米等其他物种。通过染色质免疫沉淀(ChIP)技术获得与CENH3相结合的DNA分子,并进行PCR扩增和FISH定位分析,结果显示相应的Ch IP-DNA位于水稻功能着丝粒区域。【结论】本研究制备的水稻CENH3兔源抗体能满足着丝粒研究中相关实验的要求,可进一步应用于着丝粒的结构与功能研究。

摘要：目的鉴定人肝细胞中雌激素受体α(estrogen receptorα,ESR1)基因启动子使用情况。方法常规培养和刺激HepG2和L02细胞,甲醛固定细胞,超声剪切染色质,采用利用PolⅡ CTD末端Ser5特异性抗体进行染色质免疫沉淀(PolⅡ-ChIP),针对文献报道的8个可能启动子区设计引物进行PCR扩增,鉴定ESR1基因启动子的使用情况。结果β-雌二醇刺激不同肝细胞后进行PolⅡ-ChIP发现,HepG2肝癌细胞株中ESR1启动子E1、E2、F沉淀出有PolⅡ的结合的片段,而在L02细胞株中则仅启动子D有PolⅡ的结合的片段沉淀出来。结论不同肝细胞中ESR1的表达受不同的启动子的调控。HepG2肝癌细胞株中ESR1的表达受启动子E1、E2、F调控,而在L02细胞株中ESR1的表达受启动子D调控。

摘要：目的:建立RNA多聚酶Ⅱ-染色质免疫沉淀-引物延伸-飞行时间质谱技术(PolⅡ-ChIP-PE-MS),并利用该方法检测SNP等位特异磷酸化PolⅡ结合量,为活体状态下研究疾病关联基因SNP的功能研究提供一种高通量的研究手段.方法:采用PCR-RFLP方法对HepG2细胞印迹基因SNRPN(仅父源等位基因表达)基因组DNA和cDNA进行基因分型,利用PolⅡCTD末端Ser5特异性抗体进行染色质免疫沉淀,针对SNP位点两侧序列设计PCR引物和延伸引物,以外侧引物进行PCR扩增,采用延伸引物进行VLET引物延伸,产物纯化后经MALDI-TOF质谱鉴定.结果:对SNRPN杂合子细胞的SNRPNC1654312TSNP进行PolⅡ-ChIP-PE-MS分析发现,基因组DNA样本和染色质免疫沉淀前样本在C、T等位点都包含相同PolⅡ结合量,但免疫沉淀后标本(被磷酸化RNA多聚酶Ⅱ结合的染色质)就仅在T等位点有结合,与产生mRNA转录的等位点相对应.结论:成功建立起PolⅡ-ChIP-PE-MS方法,利用该方法检测SNP等位特异磷酸化PolⅡ结合量是可靠的,可以利用PolⅡ-ChIP-PE-MS策略鉴定疾病关联基因SNP的功能.