摘要：目的分析柯萨奇病毒a组16型（CA16）昆明分离株KMM08全基因序列，了解其遗传特性。方法设计针对CA16引物，提取病毒RNA，RT-PCR扩增和产物直接测序获得序列。利用Mega4．1，RDP3和SimPlot3．5．1等软件分析全基因序列。结果获得KMM08全基因组核苷酸序列长度为7409bp，编码含2193个氨基酸残基的多聚蛋白；与其他CA16参考株核苷酸和氨基酸同源性分别为79．0％～98．2％和94．5％～99．3％，其中SZ—HK08-3与国际标准株G10核苷酸和氨基酸同源性分别79．1％和94．8％；而与肠道病毒71型（EV71）标准株BrCr同源性分别为78．7％和89．0％。在各个区段上，KMM08与***08—3的核苷酸和氨基酸同源性分别为97．0％～99．0％和98．0％-100．0％，同源性最高；与G10的核苷酸和氨基酸同源性分别为74．2％～86．9％和90．9％～97．0％；与Ev71BrCr核苷酸和氨基酸同源性分别在65．0％～84．9％和71．0％。95．2％。进化分析发现KMM08属于B基因型的一个分支。RDP3和SimPlot3．5．1软件分析发现Tainan．5079—98序列发现重组信号，而KMM08未发现。结论KMM08分离株为B基因型；CA16与EV71在非结构区发生重组。

摘要：目的了解2007年5—6月北京市儿童中流行的手足口病的病原。方法于2007年5、6月间采集来首都儿科研究所附属儿童医院门诊就诊的手足口病患儿咽拭子标本6份和1份病情危重的手足口病并发神经系统症状而急诊收住院患儿(编号F4243,年龄9岁8个月,女性)的经气管插管呼吸道抽吸液、脑脊液及血清标本。将咽拭子和气管插管抽吸液标本接种Hep-2、MDCK和Vero细胞进行病毒分离。同时设计位于肠道病毒5’非编码区(UTR)的通用引物2对(巢式PCR)、肠道病毒71型(EV71)VP1基因不同位置的特异性引物2对半(PCR和半巢式PCR)和柯萨奇病毒a组16型(CA16)的特异性引物1对检测标本中的病毒核酸。首先用随机引物将标本中的RNA逆转录成cDNA,然后分别用上述引物进行PCR扩增肠道病毒5’UTR和EV71/CA16的VP1基因片段;对EV71阳性的标本还扩增了VP1全基因,扩增产物直接进行序列测定和分析。结果6例门诊就诊的普通手足口病患儿和F4243的呼吸道标本中均扩增到肠道病毒5’UTR基因片段,有2例门诊患儿和F4243的标本中还扩增到EV71的VP1基因片段,提示该组手足口病患儿均为肠道病毒感染,其中3例为EV71感染。序列测定和分析表明有1例普通手足口病患儿(F4211)和F4243标本确定为EV71。所有标本接种Hep-2和MDCK细胞均未出现病变,说明常见的呼吸道病毒为阴性。除1份咽拭子标本(F4283)外,其余6份接种Vero细胞的标本均出现细胞病变。用肠道病毒通用引物和EV71特异性引物对分离到的病毒株核酸的扩增结果显示这6株病毒均为肠道病毒,其中F4211和F4243为EV71,与直接从呼吸道标本中扩增的结果相符;其余4株为CA16。结论北京市儿童中流行的手足口病与肠道病毒EV71和CA16感染有关;EV71可以在5岁以上儿童中引起严重的神经系统并发症,应引起注意。

摘要：目的对2009年中国云南昆明地区柯萨奇病毒a组16型(Coxsackievirus A16,CoxA16)毒株的部分VP1区进行分析,了解CoxA16的遗传特性。方法设计针对肠道病毒A群的通用引物,采用半巢式RT-PCR扩增目的片段,对PCR产物测序;使用Omiga和Mega4.1等生物学软件进行核苷酸、氨基酸序列比对及病毒的系统进化分析。结果200份2009年昆明市儿童医院临床诊断为手足口病或并发脑炎疑似肠道病毒感染的患者粪便标本中有52份为CoxA16感染,其中15份来自脑炎患者。52株CoxA16病毒部分VP1区核苷酸和氨基酸序列同源性均较高,核苷酸序列同源性为98.5%～100%,氨基酸序列同源性为98.8%～100%;与shzh00-2、shzh99-48和107/Toyama/1990相比较,核苷酸序列同源性为92.3%～93.8%,氨基酸序列同源性为95.3%～96.8%;与国际标准株G10相比较,核苷酸序列同源性为78.5%～80.3%,氨基酸序列同源性为93.2%～94.5%;与其他13个参考株的核苷酸序列同源性为96.6%～99.5%,氨基酸序列同源性为98.3%～100%。基因系统进化分析显示,52株CoxA16均属于B基因型的一个分支。结论 2009年中国云南昆明地区CoxA16株属于B2亚型。

摘要：目的 调查2019年冬季青岛市妇幼医院和中心医院手足口病(HFMD)住院患儿病原感染情况,分析柯萨奇病毒a组16型(Cox A16)基因进化特征。方法 收集2019年冬季青岛地区HFMD住院患儿104份咽拭子,采用实时荧光定量PCR进行肠道病毒核酸检测。使用肠道病毒通用分型引物扩增阳性样本,扩增序列测序后进行Blast比对。设计Cox A16 VP1全长引物,通过半巢式PCR扩增测序,使用DNAStar进行核苷酸和氨基酸的基因分析,使用MEGA软件构建进化树。结果 HFMD住院患儿的咽拭子样本肠道病毒总体阳性率为57.7%(60/104)。其中Cox A16阳性率为30.8%(32/104),Cox A6阳性率为26.9%(28/104)。对32份Cox A16阳性的样本进行VP1区全长扩增、测序并进行比对和同源性分析,其核苷酸同源性为87.0%~100%,氨基酸同源性为98.3%~100%。系统进化分析表明,32株Cox A16中有17株为Cox A16 B1a基因型,另外15株为Cox A16 B1b基因型。结论 引起2019年冬季青岛地区住院HFMD的病原体之一是Cox A16,且同时流行Cox A16的B1a和B1b型。

摘要：目的对2019年云南省手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)患者粪便中分离获得的柯萨奇病毒a组16型(Coxsackievirus A16,CVA16)毒株的全VP1基因遗传特征进行分析。方法使用人胚肺二倍体KMB-17细胞和非洲绿猴肾Vero细胞分离病毒,设计针对CVA16全VP1基因序列引物,采用RT-PCR扩增目的基因片段并测序;利用MEGA 7.0和Geneious 9.0.2等软件对全VP1序列进行分析。结果共分离获得26株CVA16毒株,其中有8株KMB-17分离株和18株Vero分离株。随机选取20株CVA16分离株进行分析,发现3株B1a和17株B1b基因亚型;其中17株CVA16 B1b分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为93.8%~100%和98.3%~100%,与国内其他分离株的核苷酸和氨基酸同源性为91.1%~99.2%和97.3%~99.0%;3株B1a分离株的核苷酸和氨基酸同源性为98.0%~98.1%和99.3%,与国内其他B1a分离株的核苷酸和氨基酸同源性为88.7%~98.7%和98.3%~99.7%;17株B1b分离株与其他3株B1a的核苷酸和氨基酸同源性为87.4%~88.4%和97.3%~98.7%。结论2019年昆明地区流行的CVA16属于B1a和B1b基因亚型,以B1b为主,且均为中国内地流行株。

摘要：目的建立快速、灵敏、特异的肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的荧光PCR检测及分型方法。方法针对肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的特异性保守基因vp1基因分别设计一对引物和对应的探针,对荧光RT-PCR反应体系进行优化,验证方法的特异性、灵敏度和重复性,并对临床样品进行检测分析。结果该方法对肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的检测有高度特异性,与甲肝、腮腺炎、风疹、乙型脑炎等病毒均无交叉反应,检测灵敏度可达10拷贝/μl;43例患儿肛拭子标本中肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型检测率分别为37.21%(16/43)和13.95%(6/43)。结论荧光RT-PCR法分型检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的方法具有快速、便捷、特异、灵敏等特点,适用于肠道病毒的早期诊断。

摘要：目的 对2018—2019年北京市柯萨奇病毒a组16型(coxasckievirus A16, CVA16)结构蛋白VP1序列进行变异分析,了解其与手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)流行的关系。方法 对2018—2019年首都医科大学附属北京佑安医院HFMD患儿标本进行逆转录聚合酶链反应(reverse triscription polymerase chain reaction, RT-PCR),测序扩增产物,获得CVA16的VP1全长序列,结合GenBank中北京及国内外CVA16代表性毒株构建系统进化树,分析VP1的氨基酸置换熵值和氨基酸的年替换比例。结果 分子进化分析表明,2018—2019年首都医科大学附属北京佑安医院26株CVA16全部为B1基因型。其中,有16株B1b型,占61.54%;10株B1a型,占38.46%。北京B1a型毒株明显分属早期和近期2个进化分支。B1a型近期分支与国内近期流行B1a型毒株、越南和泰国流行株的亲缘关系较近。通过分析VP1氨基酸置换熵值,发现2007—2019年北京CVA16 B1b型和B1a型毒株的易突变位点不同,分别为VP1-23;VP1-164和VP1-251。2012年起B1b型毒株VP1-23位点的蛋氨酸逐渐替代亮氨酸成为优势氨基酸;而近年北京B1a型毒株呈VP1-164K251I模式,与近年国内其他地区B1a型流行株及越南,泰国毒株一致。结论 2018—2019年北京市CVA16主要流行基因型为B1b型,新出现的B1a型毒株的易突变氨基酸模式与B1b型及早期B1a流行株不同,近期B1a型毒株可能由越南和泰国等国输入并在国内传播、流行。今后应加强对CVA16不同基因型及不同进化分支的动态监测和精细分析,为疫苗设计等疾病防控策略的制定和调整提供科学依据。

摘要：目的运用降落聚合酶链反应(touchdown PCR,TD-PCR)技术快速从腹泻、手足口病人粪便标本中同时检测诺如病毒(Norovius,NV)、肠道病毒71型(Enterovirus 71 EV71)和柯萨奇病毒a组16型(Coxsachie virus,CoxA16),并评价该技术用于检测这3种病毒的效能和敏感性。结论根据touchdown PCR原理设计TD-PCR程序,试验选择最佳反应条件,与普通PCR扩增效果进行评价。用10倍稀释检验TD-PCR方法的灵敏度,并用轮状病毒、札幌病毒、星状病毒、伤寒杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、香港海鸥形菌检测该方法的特异性。结果 TD-PCR能在一个反应条件下同时检测NV、EV71和CoxA16,扩增片段条带清晰,检测效果明显优于普通PCR,测序证实了3组片段的特异性,3种病毒cDNA的最低检测浓度分别为4.775μg/ml、2.360μg/ml、43.273μg/ml。检测该方法特异性时,其他病原体未见特异性条带扩增。结论成功建立的TD-PCR方法可同时检测腹泻和手足口病人粪便中NV、EV71和CoxA163种病毒,为快速检测相关病原体、科学防治腹泻和手足口病疫情暴发提供了可靠手段。

摘要：目的:建立逆转录(RT)-环介导等温扩增方法(LAMP),以快速检测手足口病最重要的两种病原体:肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒a组16型(CA16)。方法:收集手足口病患儿咽拭子标本93份,针对EV71和CA16病毒的VP1基因特异性序列8个区域各设计6条LAMP引物,分别于63℃(EV71)、65℃(CA16A)扩增1 h,日光下观察结果,与实时荧光定量PCR比较检测特异性和敏感性。结果:EV71、CA16的LAMP最低检测限均为500拷贝/管,与对照病毒无交叉反应。93份标本中,RT-PCR方法检测显示EV71阳性44例,CA16阳性36例;RT-LAMP方法检测显示EV71阳性46例,CA16阳性36例,两种方法间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:应用RT-LAMP检测手足口病病原体EV71、CA16快速、灵敏、经济、特异性高,适合在基层医疗机构推广应用。