摘要：目的 体外构建表达原核类泛素蛋白 （prokaryoticubiquitin-likeprotein,Pup）的载体是研究Pup化靶蛋白的重要基础,为了提高蛋白纯化的效能和特异性需要构建带组氨酸 （his6）和链霉素 （strep）标签的Pup蛋白表达载体,为后续研究Pup-蛋白酶体在分枝杆菌中的应激调控奠定基础。方法 设计合成his6-strep片段,扩增富集his6-strep片段,从结核分枝杆菌 H37Rv基因组扩增Pup片段;应用GibsonAssembly系统采用同源片段重组方法将his6-strep片段和Pup片段依次连接到载体上,构建带双标签的原核表达载体 pET28a-his6-strep-Pup和大肠肝菌-结核杆菌穿梭质粒pMV261-his6-strep-Pup表达载体,经酶切和聚合酶链反应验证,分别导入大肠杆菌 （***）和耻垢分枝杆菌 （***）中,鉴定和测序获得正确单克隆菌株。培养富集菌株,超声破碎离心收集上清和沉淀,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）电泳,用免疫印迹法 （Westernblot）验证标签蛋白在***和***中的表达。结果 经聚合酶链反应鉴定及测序,证实成功构建了双标签Pup表达载体并导入目的菌株,诱导后蛋白表达,Westernblot结果表明标签蛋白在***和***中均可得到正确表达,在***中可发现多种靶蛋白被Pup化结合。结论 快速高效地构建了表达his6-strep-Pup蛋白的双标签重组载体,可以应用于后续Pup的表达纯化及Pup化蛋白的功能分析,为进一步开展对Pup-蛋白酶体在分枝杆菌应激调控中的功能研究打下了良好的基础。

摘要：目的体外构建表达原核类泛索蛋白（prokaryotic ubiquitin-like protein，Pup）的载体是研究Pup化靶蛋白的重要基础，为了提高蛋白纯化的效能和特异性需要构建带组氨酸（his6）和链霉素（strep）标签的Pup蛋白表达载体，为后续研究Pup-蛋白酶体在分枝杆菌中的应激调控奠定基础。方法设计合成his6-strep片段，扩增富集***片段，从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增Pup片段；应用Gibson Assembly系统采用同源片段重组方法将his6-strep片段和PUP片段依次连接到载体上，构建带双标签的原核表达载体pET28a—his6-strep-Pup和大肠肝菌-结核杆菌穿梭质粒pMV261-his6-strep—Pup表达载体，经酶切和聚合酶链反应验证，分别导人大肠杆菌（***）和耻垢分枝杆菌（***）中，鉴定和测序获得正确单克隆菌株。培养富集菌株，超声破碎离心收集上清和沉淀，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）电泳，用免疫印迹法（Western blot）验证标签蛋白在***和***中的表达。结果经聚合酶链反应鉴定及测序，证实成功构建了双标签Pup表达载体并导人目的菌株，诱导后蛋白表达，Western blot结果表明标签蛋白在***和***中均可得到正确表达，在***中可发现多种靶蛋白被Pup化结合。结论快速高效地构建了表达***蛋白的双标签重组载体，可以应用于后续Pup的表达纯化及Pup化蛋白的功能分析，为进一步开展对Pup-蛋白酶体在分枝杆菌应激调控中的功能研究打下了良好的基础。

摘要：目的:对小鼠内源性NPC1L1蛋白进行标记和示踪,为研究体内胆固醇的吸收机制提供新的技术手段。方法:利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,针对小鼠NPC1L1基因的3′末端非编码区,设计不同sgRNA,利用细胞内的荧光素酶法,检测分析其Cas9/sgRNA核酸酶活性,筛选出高活性的sgRNA序列,经体外转录制备sgRNA和Cas9 mRNA。PCR扩增基因打靶的两侧同源臂,与FLAG-EGFP的编码cDNA一起克隆至打靶载体。经酶切和测序鉴定正确的打靶载体DNA与sgRNA、Cas9 mRNA一起显微注射入小鼠受精卵,移植至假孕小鼠体内自然发育;通过基因组DNA的PCR和Southern印迹分析,筛选、鉴定重组正确且无随机插入的子代小鼠。制备小肠组织冰冻切片,荧光显微镜下观察NPC1L1-EGFP的表达分布。结果:成功构建了NPC1L1基因敲入打靶载体,筛选了高活性的sgRNA,利用CRISPR/Cas9技术获得了对内源性NPC1L1蛋白C端进行FLAG和EGFP双重标记的子代小鼠,荧光显微镜下观察到该融合蛋白分布于小肠绒毛上皮细胞的刷状缘,与NPC1L1的分布特征一致。结论:成功实现了对小鼠内源性NPC1L1蛋白进行体内标记,为研究NPC1L1囊泡转运和胆固醇吸收机制提供了有效手段。