摘要：目的研究健脾方对慢性乙型肝炎(简称慢乙肝)患者树突细胞(DC)功能的影响。方法筛选慢乙肝脾虚证患者60例,随机分为治疗组和对照组各30例。对照组给予干扰素(赛诺金500万U,肌肉注射,每周3次),治疗组在此基础上加用健脾方(每日1剂,分2次服用),用药6个月。分离培养外周血DC,流式细胞仪测定DC表面HLA-DR、CD86、CD80、CD40、CD14、CD11c的表达,混合淋巴细胞反应测定两组DC的功能,治疗前后各检测1次。结果治疗组DC表面的CD86、CD80、CD40、CD11c明显高于对照组(P<0.01或P<0.05)。刺激指数、IFN-γ、IL-12的变化亦显著优于对照组(P<0.05)。结论健脾方明显改善DC的功能,调节免疫功能可能是其提高临床疗效的机理之一。

摘要：背景:成熟树突细胞可通过其表面抗原CD80/CD86来启动Th细胞活化,促使Th细胞向Th1细胞分化减少、向Th2细胞方向分化增多。目的:探讨小干扰RNA抑制哮喘小鼠成熟树突细胞表面抗原CD80/CD86表达后对Th1及Th2型细胞因子干扰素γ、白细胞介素4分泌的影响。方法:建立哮喘小鼠模型,分离哮喘小鼠骨髓成熟树突细胞,流式细胞术检测表面标记物CD11c、CD80、CD86的阳性表达率;设计合成CD80/CD86相关小干扰RNA转染哮喘小鼠成熟树突细胞,荧光定量PCR、流式细胞术检测干扰前后成熟树突细胞中CD80/CD86 mRNA和相应蛋白的表达,将干扰组、未干扰组、转染试剂对照组的成熟树突细胞分别与小鼠T淋巴细胞共培养,ELISA检测上清液中Th1及Th2型细胞因子干扰素γ、白细胞介素4分泌水平。结果与结论:①正常组成熟树突细胞的CD80/CD86的表达与哮喘组相比均明显降低(均P<0.05)。②小干扰RNA转染哮喘小鼠成熟树突细胞后,干扰组CD80/CD86 mRNA及其蛋白表达水平较其他组均明显降低(均P<0.05)。③小干扰RNA转染后干扰组共培养体系中干扰素γ水平明显高于其他组(均P<0.05),白细胞介素4水平则明显低于其他组(均P<0.05)。提示哮喘小鼠成熟树突细胞高表达CD80/CD86,小干扰RNA特异性抑制哮喘小鼠成熟树突细胞中CD80/CD86的表达,能增加干扰素γ并减少白细胞介素4的分泌,从而纠正Th1/Th2失衡。

摘要：目的探讨靶向趋化因子受体CCR7的反义肽核酸(PNA)对树突细胞(DCs)CCR7的表达及趋化活性的影响。方法体外培养大鼠骨髓来源DCs,设计靶向CCR7mRNA翻译起始区的反义PNA,以随机PNA、空白组为对照处理体外培养7d的DCs,分别于24h,48h,72h后收集细胞,利用Western-blot和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测反义PNA对CCR7分子表达的影响,通过趋化实验检测DCs的趋化活性。结果DCs经PNA处理后24h,各组DCs其CCR7表达无明显差别,在48h,Western-blot检测显示反义PNA组CCR7蛋白表达明显低于对照组,而RT-PCR检测在mRNA水平却无明显差别。在72h,反义PNA组CCR7的表达在不同水平均明显低于对照组。经趋化实验证实,在48h以后反义PNA组DCs趋化活性受到明显抑制(P<0.05)。结论CCR7反义PNA能够有效抑制体外培养的大鼠树突细胞趋化因子受体CCR7的表达及其趋化活性,为进一步研究体内应用反义PNA抑制DCs的定向迁移和抗原递呈,调节免疫反应和诱导免疫耐受提供了新的策略。

摘要：目的探讨序列相似性家族134成员B(FAM134B)介导的内质网自噬对内毒素/脂多糖(LPS)诱导的小鼠树突状细胞(DC)凋亡的影响,为改善创面感染等引起的脓毒症免疫抑制提供依据。方法采用实验研究方法。取第3~10代对数生长期的小鼠DC系DC2.4进行实验。将DC分为LPS刺激0 h(不刺激)组、LPS刺激6 h组、LPS刺激12 h组、LPS刺激24 h组和LPS刺激72 h组,采用1μg/mL LPS(浓度下同)培养相应时间后,采用蛋白质印迹法检测FAM134B、微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)以及转运蛋白SEC61B蛋白表达,并计算LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值(样本数为3)。将DC分为进行相应处理的磷酸盐缓冲液(PBS)组与LPS组,培养24 h,采用免疫荧光法检测FAM134B表达情况及其分别与溶酶体探针、LC3B共定位情况,通过透射电子显微镜观察细胞内自噬溶酶体数量。将DC分为转染含FAM134B基因小干扰RNA序列的慢病毒的敲减FAM134B组与转染空载慢病毒的空载体组,转染后72 h,于倒置荧光相差显微镜下观察细胞荧光表达情况,另将仅常规培养的DC设为空白对照组并于相应时间点行相同观察。将DC分为单纯PBS组、单纯LPS组,将成功转染含FAM134B基因小干扰RNA序列的慢病毒的DC分为敲减FAM134B+PBS组、敲减FAM134B+LPS组,将成功转染空载慢病毒的DC分为空载体+PBS组、空载体+LPS组,给予相应刺激并培养24 h,采用蛋白质印迹法检测FAM134B蛋白表达(样本数为3),通过流式细胞术检测细胞凋亡率(样本数为3),行Hoechst染色观测细胞凋亡情况并计算凋亡率(样本数为5),采用蛋白质印迹法检测剪切型胱天蛋白酶3(caspase-3)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达并计算Bax/Bcl-2比值(样本数为5)。对数据行单因素方差分析、LSD检验、析因设计方差分析。结果与LPS刺激0 h组相比,LPS刺激12 h组和LPS刺激24 h组细胞中FAM134B蛋白表达均明显升高(P<0.05),LPS刺激6 h组、LPS刺激12 h组、LPS刺激24 h组和LPS刺激72 h组细胞中SEC61B蛋白表达均明显降低(P<0.05),LPS刺激24 h组和LPS刺激72 h组细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值均明显升高(P<0.05),其中LPS刺激24 h组细胞中3个蛋白的变化最显著,将24 h作为后续LPS刺激时长。培养24 h,与PBS组相比,LPS组细胞中FAM134B的表达及其与LC3B及溶酶体探针的共定位均显著增强,自噬溶酶体数量明显增多。空载体组与敲减FAM134B组细胞转染后72 h均表现出高强度荧光,而空白对照组细胞在相应时间点无荧光表现。培养24 h,敲减FAM134B+PBS组细胞中FAM134B蛋白表达较单纯PBS组和空载体+PBS组明显降低(P值均<0.05),敲减FAM134B+LPS组细胞中FAM134B蛋白表达较单纯LPS组和空载体+LPS组显著降低(P值均<0.05),单纯LPS组细胞中FAM134B蛋白表达较单纯PBS组明显升高(P<0.05),空载体+LPS组细胞中FAM134B蛋白表达较空载体+PBS组明显升高(P<0.05)。培养24 h,流式细胞术检测显示,单纯PBS组、单纯LPS组、空载体+PBS组、空载体+LPS组、敲减FAM134B+PBS组与敲减FAM134B+LPS组细胞凋亡率分别为(13.3±0.8)%、(32.6±4.3)%、(17.0±1.5)%、(51.7±3.3)%、(52.4±3.1)%与(62.3±2.6)%。培养24 h,与单纯LPS组和空载体+LPS组相比,敲减FAM134B+LPS组经流式细胞术与Hoechst染色检测的细胞凋亡率以及细胞中剪切型caspase-3蛋白表达、Bax/Bcl-2比值均明显升高(P<0.05);与对应的PBS处理组即单纯PBS组、空载体+PBS组、敲减FAM134B+PBS组相比,单纯LPS组、空载体+LPS组、敲减FAM134B+LPS组经流式细胞术与Hoechst染色检测的细胞凋亡率以及细胞中剪切型caspase-3蛋白表达、Bax/Bcl-2比值均明显升高(P<0.05)。结论小鼠DC中FAM134B介导的内质网自噬在LPS刺激下活化增强并于24 h达活化高峰,且活化的内质网自噬对细胞凋亡具有显著抑制效应。

摘要：目的探讨抑制MCF-7乳癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)的表达对树突细胞(DC)免疫功能的影响。方法针对VEGF基因设计小干扰RNA(siRNA),以脂质体转染法将siRNA导入乳癌细胞MCF-7,RT-PCR检测干扰VEGF基因后mRNA的表达,Western blotting法检测VEGF蛋白的表达,观察VEGF基因沉默效果。以MCF-7乳癌细胞的培养上清和干扰VEGF基因后MCF-7乳癌细胞培养上清液同时添加粒-单细胞集落刺激因子、白细胞介素-4、肿瘤坏死因子α培养正常异基因DC,利用MTT法和Hoechst33258检测DC刺激正常外周血T细胞增殖的能力及DC激发的细胞毒T淋巴细胞(CTL)杀伤活性;ELISA法检测DC培养上清液中白细胞介素12(IL-12)及DC与外周血单个核细胞(PBMC)共同培养液中干扰素γ(IFN-γ)的含量。结果VEGF基因经siRNA处理24 h后,MCF-7乳癌细胞VEGF mRNA和蛋白的表达明显降低,其诱生的DC与MCF-7乳癌细胞培养上清液诱生的DC相比,siRNA处理DC刺激T淋巴细胞增殖能力、CTL杀伤活性以及DC分泌IL-12和协同刺激外周血PBMC分泌INF-γ的能力明显增强。结论siRNA可靶向抑制乳癌MCF-7细胞VEGF的表达,下调VEGF后的MCF-7细胞上清液对DC分化成熟及功能的抑制作用明显降低。

摘要：近年来,树突状细胞(dendritic cells, DC)作为抗原提呈能力最强的、也是惟一能激活初始型T细胞的专职抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC),已成为肿瘤生物治疗领域备受关注的焦点之一.

摘要：背景:研究表明,树突状细胞接受刺激的性质和微环境及其起源是决定免疫反应中初始CD4+T细胞发生Th1或Th2应答的关键因素,树突状细胞是否成熟对其功能的发挥影响很大。目的:观察广泛应用的细胞因子α-干扰素对人外周血单核细胞向树突状细胞分化成熟的影响。设计、时间及地点:细胞水平的观察对照实验,于2007-05/12在深圳市人民医院临床医学研究中心实验室完成。材料:取10名健康成人志愿者的外周血。方法:采集外周血10mL,肝素抗凝,常规淋巴细胞分离液分离单核细胞,然后将单核细胞与粒-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4体外培养7d。分3组进行树突状细胞培养,对照组不加α-干扰素;100U/Lα-干扰素组于培养第5天加入100U/L的α-干扰素;300U/Lα-干扰素组于培养第5天加入300U/L的α-干扰素。主要观察指标:培养第7天用流式细胞术检测树突状细胞膜表面CD83和MHC-DR表达水平;应用四氮唑盐法测定树突状细胞刺激同种异体T细胞增殖的能力;采用酶联免疫吸附法检测树突状细胞培养上清中白细胞介素12p40+p70含量。结果:100,300U/Lα-干扰素组中CD83+和MHC-DR+树突状细胞的数量、刺激同种异体T细胞增殖的能力及培养上清液中白细胞介素12p40+p70水平均显著高于对照组(P<0.01),并以300U/Lα-干扰素组作用更强。结论:α-干扰素可以有效促进单核细胞源树突状细胞的功能成熟,并呈剂量依赖效应。

摘要：目的研究反义肽核酸（PNA）下调树突状细胞（DC）趋化因子受体CCR7基因表达在大鼠肝移植急性排斥反应中的作用。方法体外培养大鼠骨髓来源的DC，设计靶向CCR7mRNA翻译起始区的反义PNA组，以随机PNA组和空白组为对照。免疫细胞化学染色法检测反义PNA对CCR7蛋白表达的影响；趋化试验检测DC的趋化活性。建立大鼠肝移植排斥反应模型，在供肝冷保存和肝移植术后应用反义PNA，以随机PNA组和空白组为对照，观察术后受者存活时间。于术后第7、10天取移植物标本观察肝脏病理学改变；免疫组织化学染色法检测淋巴结DC数量变化以及T淋巴细胞的活化增殖情况。结果反义PNA显著下调体外培养的DC表达CCR7蛋白，DC体外趋化活性受到明显抑制，与随机PNA组和空白组相比，差异有统计学意义（P〈0．05）。肝移植术后，反义PNA组与随机PNA组和空白组相比，受者腹腔淋巴结中DC数量明显减少，T淋巴细胞活化增殖受到显著抑制，受者术后存活时间明显延长（P〈0．05）。结论通过反义PNA下调CCR7基因表达，阻断DC迁移和抗原提呈，能有效抑制急性排斥反应，延长受者存活时间。

摘要：目的:通过建立MCF-7荷瘤裸鼠模型,研究树突状细胞(DCs)不同亚群的凋亡,为设计新的免疫治疗方法和新的疫苗提供详尽信息。方法:建立MCF-7裸鼠模型,随机分为荷瘤组和对照组,肿块达5 mm后处死裸鼠,取骨髓单个核细胞进行DCs诱导、分化,流式细胞仪上检测表面分子标志CD86、CD83、MHC-Ⅱ及CD34,AnnexinⅤ检测CD11c及CD123了解DCs亚群的凋亡率。结果:骨髓起源单个核细胞培养至第9天出现典型DCs形态特征,荷瘤组和对照组细胞均高表达CD86、CD83及MHC-Ⅱ,而CD34表达两组均较低。荷瘤组CD11c+CD123-细胞为(52.01±1.43)%,对照组为(56.36±1.76)%;CD123+CD11c-细胞荷瘤组为(32.19±1.71)%,对照组为(28.95±1.39)%。荷瘤组mDC凋亡率为(23.64±2.43)%,较对照组(20.05±2.49)%高,P<0.05。荷瘤组小鼠pDC凋亡率为(11.53±2.92)%,较对照组(14.96±2.96)%低,P<0.05。结论:MCF-7乳腺癌小鼠体内DCs存在mDC和pDC两种亚型,mDC凋亡率增加,使诱导Th1免疫反应能力减低;而pDC凋亡率减少,诱导体内免疫耐受的发生,机体抗肿瘤免疫反应能力因而下降。

摘要：背景:诱导供者特异性免疫耐受被认为是最终克服器官移植后排斥反应的有效途径,近年来关于未成熟树突状细胞在诱导免疫耐受中的重要作用日益受到关注。目的:观察他克莫司处理的供者未成熟树突状细胞对大鼠同种异体心脏移植免疫耐受的影响,分析未成熟树突状细胞诱导免疫耐受的作用途径。设计:随机对照动物实验。材料:实验于2006-04/2006-12在青岛大学医学院附属医院动物实验中心完成。以45只Wistar大鼠为供体,45只SD大鼠为受体,行颈部心脏移植45例次。按随机数字表法分为3组,每组15例次,进行不同的预处理。方法:对照组、未经他克莫司处理组及他克莫司处理组移植前7d分别经尾静脉注射生理盐水、供者未成熟树突状细胞和他克莫司处理的未成熟树突状细胞。分别测定移植后SD大鼠与Wistar大鼠及第3品系Lewis大鼠的单向混合淋巴细胞反应。主要观察指标:各组受体大鼠移植心脏存活时间、心肌病理及血清白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素10、γ-干扰素含量变化。结果:①未经他克莫司处理组大鼠的移植心脏存活时间较对照组明显延长(P<0.01),他克莫司处理组大鼠的移植心脏存活时间进一步延长(P<0.05)。②混合淋巴细胞培养结果显示为供者特异性。③各组大鼠血清白细胞介素2、γ-干扰素、白细胞介素4、白细胞介素10含量差异具有显著性意义(P<0.01)。代表Th1的白细胞介素2、γ-干扰素水平明显降低,代表Th2的白细胞介素4、白细胞介素10水平明显增高。结论:未成熟树突状细胞能够诱导同种异体大鼠心脏移植免疫耐受;他克莫司处理的未成熟树突状细胞能够加强这种免疫耐受,且这种耐受是供者特异性的。其可能主要通过调节T细胞免疫应答类型(Th1至Th2的免疫偏移)、诱导调节性T细胞和诱导T细胞失能等途径来参与免疫耐受的形成。