摘要：目的构建针对核干细胞因子(NS)基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体。方法根据GenBank提供的NS基因AY825265mRNA序列及siRNA设计原则设计siRNA,筛选得到126-144nt,199-217nt和487-505nt3个19bp片段为靶序列;合成带有BamHI、XhoI酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,经过退火,将此序列克隆至载体pRNAT-U6.1中构建重组表达载体;转化DH5α,提取质粒,应用PCR技术和测序方法鉴定重组克隆。转染入食管癌EC9706细胞,检测NS基因沉默情况。结果PCR筛选得到3个目的片段的阳性重组克隆,测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致。RT-PCR和Westernblot检测显示构建的siRNA表达载体可显著降低EC9706细胞中NSmRNA和蛋白水平的表达。结论成功构建出一组针对NS基因的siRNA表达载体,为下一步NS基因的RNA干扰研究鉴定了基础。

摘要：目的构建针对核干细胞因子(Nucleostemin)基因寂寞的RNA干扰腺病毒载体,观察其干扰作用。方法根据克隆的全长Nucleostemin基因(1 650bp,GenBank接受序号:AY825265)设计RNA干扰反向重复序列,采用分子生物学组装腺病毒载体,制备高效价RNAi重组腺病毒。实验分为Backbone-P1P2重组腺病毒感染组(P1P2干扰组)、Backbone-P3P4重组腺病毒感染组(P3P4干扰组)、Backbone空质粒病毒感染对照组(B组)和无病毒感染对照组。不同剂量腺病毒液RNAi(分别为60、30、15和7.5μL)转染F6细胞及U937细胞,采用蛋白质印迹法检测F6细胞及U937细胞中核干细胞因子的蛋白表达水平,采用实时荧光定量PCR(QPCR)检测U937细胞中核干细胞因子的mRNA表达水平。计数法绘制细胞生长曲线,判定细胞活力;流式细胞术检测细胞周期变化。结果靶向核干细胞因子基因的腺病毒RNA干扰载体(Backbone-P1P2,Backbone-P3P4)被成功构建。蛋白质印迹法检测结果显示,F6细胞内不同梯度浓度腺病毒RNA干扰后,核干细胞因子表达量分别为1.23、4.48、5.03和5.75,随P3P4片段RNA干扰浓度梯度下降而核干细胞因子表达量呈上升趋势。P1P2干扰组蛋白水平为0.219±0.051,与空质粒转染对照组的2.174±0.196比较明显降低,F=279.4,P<0.001;P3P4干扰组蛋白水平为0.0164±0.003,与空质粒转染对照组比较明显降低,F=363.4,P<0.001。P1P2干扰组基因表达水平为1.585±0.20,与空质粒转染对照组的3.932±0.271比较明显降低,F=145.9,P<0.001;P3P4干扰组基因表达水平为1.328±0.251,与空质粒转染对照组比较明显降低,F=149.9,P<0.001。细胞周期实验发现,核干细胞因子干扰后,P1P2腺病毒RNA干扰组为44.89±4.04,与空质粒转染对照组的54.74±3.28对比减低,F=10.75,P=0.031;P3P4干扰组为45.00±3.82,与空质粒转染对照组对比减低,F=11.23,P=0.029;S期+G2M期细胞P1P2干扰组为55.11±2.81,与空质粒转染对照组的45.26±1.72对比升高,F=26.82,P=0.007;P3P4干扰组为55.00±2.64,与空质粒转染对照组相比明显升高,F=28.67,P=0.006。表明核干细胞因子在细胞周期中阻碍G2/M检验点通过。结论成功构建针对核干细胞因子基因沉默的RNA干扰腺病毒载体,该病毒载体可特异有效的沉默下调核干细胞因子基因的表达,为今后研究核干细胞因子功能奠定了基础。

摘要：目的:检测全反式维甲酸(ATRA)诱导后HL-60细胞核干细胞因子(NS)mRNA表达的变化,探讨NS mRNA表达与细胞分化之间的关系。方法:从NS基因的3个变异体中筛选出共同序列设计特异性引物,用终浓度为0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L的ATRA诱导分化HL-60白血病细胞48h,以不加ATRA的HL-60细胞作为对照,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测HL-60细胞NS mRNA表达水平的变化。结果:ATRA诱导HL-60细胞分化后NS mRNA表达均有所降低,0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L浓度下NS mRNA表达量分别下降3.72%±0.84%、58.70%±4.98%和61.60%±2.26%。其中1μmol/L和10μmol/L组与对照组和0.1μmol/L组比较,差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论:NS可能与白血病细胞分化有关,参与调控细胞分化过程。

摘要：目的构建核干细胞因子基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体并对其在白血病细胞株中的干扰效果进行鉴定,为后期研究奠定基础。方法针对核干细胞因子基因的序列设计RNAi有效靶点,合成含RNA干扰序列、Loop环、AgeⅠ和EcoRⅠ酶切位点,以及终止信号的单链DNA oligo,经退火形成双链DNA,与双酶切线性化的带有GFP荧光标记和嘌呤霉素抗性标记的GV248慢病毒空载体进行连接产生重组慢病毒载体,转化感受态细菌,挑取重组阳性转化子进行菌落PCR反应,并对PCR阳性克隆进行测序。将重组慢病毒载体及其两种辅助包装原件载体质粒pHelper1.0和pHelper2.0共转染293T细胞进行病毒的包装,收集、浓缩病毒液后测定其滴度,并转染HL-60、NB4以及K562等三种人白血病细胞株,倒置荧光显微镜下观察其转染效率,real-time PCR检测核干细胞因子基因的敲减效率。结果经测序证实正确构建出了核干细胞因子基因的RNAi重组慢病毒载体,包装、浓缩后其滴度为4×108TU/ml,荧光显微镜下显示其能有效转染进入HL-60、NB4及K562等白血病细胞株中,转染效率均在80%以上;real-time PCR显示转染后核干细胞因子基因mRNA表达水平较阴性对照组显著下降(P<0.05),在HL-60、NB4和K562细胞中核干细胞因子基因的抑制效率分别为52.3%、80.5%、62.3%。结论成功构建出了核干细胞因子基因的RNAi慢病毒载体,其能有效干扰人白血病细胞株HL-60、NB4及K562中的核干细胞因子基因表达。

摘要：目的探讨A549细胞株NS基因的表达干扰后,A549细胞株的mRNA表达水平及细胞增殖变化。方法构建NS shRNA真核表达载体,转染A549细胞,G418筛选稳定表达细胞克隆,RT-PCR检测NS基因沉默,MTT检测细胞增殖情况。结果构建的NS shRNA真核表达载体经菌落PCR和测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致。RT-PCR检测显示构建的shRNA表达载体转染A549细胞后可显著降低NS mRNA的表达;MTT结果显示干扰后细胞增殖速率明显减低。结论成功构建了一组针对NS基因的shRNA真核表达载体,转染A549细胞后NS基因表达被特异性沉默,且细胞增殖受到明显抑制,通过RNAi技术实现NS基因沉默可能是一种较有前景的肿瘤治疗方法。