摘要：核糖核酸干扰(RNAi)是指一个由双链RNA诱导具有相同碱基序列的靶标RNA降解的现象,它是沉默基因表达的一个十分有效的手段.RNAi导致基因沉默的机制可分为以下两步:首先由核酸酶Dicer切割长的双链RNA形成小片段碱基(19～25)的siRNA.然后,这些siRNA组成一个RNA诱导沉默复合体(RISC),并且siRNA被一个内源激酶磷酸化,双链siRNA打开,让反义RNA引导RISC至其目的信使RNA(mRNA),从而使其目的mRNA内切降解.RNAi技术可以应用到许多生命科学研究方面,如功能基因组以及医药研究.同时讨论了RNAi的一些最新进展如siRNA的设计和导入细胞的方法.

摘要：目的:构建核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)p65亚基特异的核糖核酸干扰腺病毒表达载体,验证其对p65亚基的沉默效应。方法:设计针对大鼠NF-κB p65亚基的不同干扰序列,通过质粒将其导入腺病毒,感染大鼠心肌细胞(H9C2)。将感染后的心肌细胞通过RT-PCR方法和Western Blot方法检测各组NF-κB p65的基因水平表达和蛋白质水平表达。结果:成功构建了NF-κB p65亚基特异的RNAi腺病毒表达载体,获得高滴度的腺病毒液;RNAi腺病毒感染H9C2细胞后可以高效抑制NF-κB p65蛋白的表达。结论:RNAi技术能有效的沉默大鼠心肌细胞NF-κB p65的表达。

摘要：目的:探讨血管壁组织因子小干扰核糖核酸(siRNA)对大鼠血管平滑肌细胞组织因子基因沉默作用的可行性和有效性。方法:设计并合成针对大鼠组织因子的25 bp双链siRNA分子。使用组织因子siRNA、对照siRNA转染大鼠血管平滑肌细胞,同时设立空白对照,实验共分6组(各组n=5)。荧光显微镜观察转染效率。血小板源性生长因子-BB刺激血管平滑肌细胞后逆转录多聚酶链反应检测组织因子信使核糖核酸表达,免疫印迹和免疫组化检测组织因子蛋白表达。结果:siRNA成功转染到血管平滑肌细胞,转染效率约(90.0±2.3)%。3对候选siRNA筛选出基因抑制效率最高一对,与阴性对照组相比,转染24 h组织因子信使核糖核酸表达减少(86.0±0.6)%,转染48 h蛋白质印迹分析组织因子蛋白表达减少(92.0±1.0)%,同时免疫组化检测组织因子表达明显减弱。结论:RNA干扰能明显下调大鼠血管平滑肌细胞组织因子表达。

摘要：为了解析不同srGAP蛋白在神经元发育中的补偿效应,构建了一种同时靶向srGAP家族成员srGAP1～3的串联短发夹RNA表达系统.通过设计,合成多个寡核苷酸,利用微小RNA表达载体构建相应srGAP基因的短发夹RNA表达质粒,并利用蛋白免疫印迹法筛选敲减作用明显的靶向不同srGAP基因的短发夹RNA,然后,将其串联到同一载体而构建成可以同时靶向srGAP家族的短发夹RNA串联重组质粒.结果表明,筛选得到了分别针对srGAP1～3的短发夹RNA J17、J24和J33,并构建出能够同时靶向srGAP1～3基因的串联短发夹RNA J1+2+3.

摘要：目的构建肌浆网-内质网钙离子转运ATP酶(SERCA)基因的干扰慢病毒表达载体,建立稳定转染的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC 12)细胞系。方法人工设计、合成针对SERCA基因干扰序列,退火后连接到PGLV3干扰载体上,与p Gag/Pol、pRev、p VSV-G共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度,感染PC 12细胞,建立稳定细胞株;应用RT-PCR和Western blot技术检测PC 12稳定细胞中SERCA基因和蛋白表达情况,并与对照组进行比较。结果成功构建了针对SERCA基因的RNAi慢病毒表达载体,病毒滴度为3×108U·m L-1;建立稳定转染的PC 12细胞株。有效干扰验证显示,sh SERCA能明显降低SERCA的mRNA及蛋白水平(P<0.01)。结论成功构建SERCA基因的sh SERCA慢病毒表达载体,建立稳定干扰SERCA表达的PC 12细胞株。

摘要：目的 利用RNA干扰技术抑制人食管癌细胞（ECA109）信号转导与转录活化因子1（STAT 1）基因表达,观察其对放射敏感性和细胞周期影响。 方法 针对基因STAT 1 设计构建干扰质粒pSTAT 1-shRNA,与慢病毒包装质粒混合后共同转染293T细胞,收集病毒液感染ECA109细胞。采用RT-PCR和蛋白印迹法测定STAT 1在mRNA水平和蛋白水平的表达,采用克隆形成实验和流式细胞术检测ECA109细胞放射敏感性和周期分布。 结果 空白对照、转染阴性、转染阳性细胞的D 0-值分别为2.98、3.02、2.03,SF2分别为0.88、0.88、0.83,Dq值分别为1.39、1.57、1.20。4 Gy照射后12、24、48 h 转染阳性细胞比空白对照和转染阴性细胞的G1G0期比例增高（34.13%∶22.03%∶22.27%、43.80%∶28.40%∶28.63%、53.20%∶42.2%∶41.83%,F=7.56、10.01、10.73,P=0.023、0.012、0.010）和G2＋M期比例降低（14.33%∶32.23%∶32.23%、27.73%∶43.53%∶44.00%、14.23%∶27.97%∶27.93%,F=16.86、26.62、40.34,P=0.003、0.001、0.000）。结论 RNA干扰不影响ECA109细胞的增殖活性,可能是通过调节照射后细胞周期分布来增加放射敏感性。

摘要：目的观察骨桥蛋白(OPN)RNA干扰(siRNA)在肝癌HepG2细胞中的沉默效应。方法设计合成骨桥蛋白RNA干扰寡核苷酸片段,将之克隆至pGCsi真核表达载体上,并经测序分析鉴定。用脂质体法将质粒转染HepG2细胞筛选稳定转染OPNsiRNA的细胞,并经Westernblot鉴定。结果成功构建3个pGCsiOPN质粒,瞬时转染293T细胞后发现pGCsiOPN2有干扰效应;进一步稳定转染肝癌HepG2细胞,筛选到4株阳性细胞克隆。结论OPNsiRNA在肝癌HepG2细胞中有沉默效应。

摘要：目的探讨携带大鼠细胞间黏附分子1(ICAM-1)核糖核酸干扰(RNAi)的重组慢病毒构建方法,筛选出基因抑制效率最高的重组慢病毒。方法(1)根据基因序列,设计并合成针对4个靶点的寡核苷酸,将其与双链DNAoligo进行连接反应;将连接产物转化DH5α大肠杆菌,PCR筛选获得阳性克隆并进行基因测序。(2)将重组载体与病毒包装质粒共转染人胚肾293T细胞,获得病毒颗粒。(3)重组慢病毒体外转染NRK细胞,以RT-PCR法筛选出基因抑制效率最高的重组慢病毒。结果(1)经过酶切、连接、转化后获得阳性克隆;基因测序结果完全正确。(2)经RT-PCR证实,3号病毒在感染复数(MOI)=50时,基因抑制率即达到88.4%。结论成功构建了含有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的大鼠ICAM-1RNAi慢病毒载体。

摘要：目的研究构建大鼠细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS3)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体的方法。方法根据大鼠SOCS3基因(NM053565),用Ambion在线软件选择3个靶序列,设计并合成包含各正反义靶序列的互补单链寡核苷酸,与经BamHⅠ和XhoⅠ酶切后的慢病毒载体质粒pRNA-Lenti-绿色荧光蛋白(GFP)(含U6启动子和GFP)连接产生pRNA-Lenti-SOCS3-GFP慢病毒重组质粒,然后分别转染C6大鼠神经胶质瘤细胞,通过荧光显微镜观察细胞转染情况,利用荧光实时定量PCR方法检测RNAi组(siRNA1、siRNA2、siRNA3),空白细胞组和阴性序列组(siRNA-Negative)SOCS3的表达情况,筛选出干扰效果最佳的重组质粒。此慢病毒重组质粒与慢病毒包装混合物共转染293T细胞,包装产生慢病毒,收集病毒上清,采取系列稀释法测定慢病毒滴度。结果将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功。荧光实时定量PCR检测显示慢病毒重组质粒感染C6大鼠神经胶质瘤细胞后,与空白细胞组比较,3个RNAi组均不同程度地抑制SOCS3表达,其中siRNA1组抑制效果最佳,可使SOCS3 mRNA表达量下调达80%。系列稀释法检测慢病毒悬液的滴度为1.0×1010TU.L-1。结论运用pRNA-Lenti-GFP载体构建的pRNA-Lenti-SOCS3-GFP慢病毒载体可有效地抑制大鼠SOCS3的表达。大鼠SOCS3基因RNAi慢病毒载体的构建成功,为SOCS3相关疾病的深入研究和治疗奠定基础。

摘要：为了设计高效的siRNA(Short-interfering Ribonucleic Acid)分子、最大限度地减少siRNA分子的脱靶效应(off-target effects),siRNA分子设计已经成为热门研究领域。siRNA分子设计主要是基于序列和能量特征,以及靶标的二级结构特征,基于这些特征设计的siRNA分子已经有了较高的抑制基因表达的效率。RNAi(RNA in-terference)在基因发现以及疾病治疗领域已有非常广泛的应用,就siRNA分子设计近年的研究进展作一综述,为今后siRNA研究提供参考。