摘要：目的 探讨SHANK蛋白RH区域交互作用蛋白（SHARPIN）对前列腺癌细胞凋亡调控机制.方法 设计并合成抑制SHARPIN的小干扰RNA 3对,实时荧光定量聚合酶链反应法（FQ-PCR）筛选抑制效率最高者;Western blot验证对前列腺癌细胞中SHARPIN表达的抑制效果.Western blot检测各组中SHARPIN、生存素（Survivin）表达和核转录因子-κB（NF-κB）磷酸化情况;四唑氮化合物（MTS）法检测增殖能力;流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 FQ-PCR显示第3对序列对SHARPIN抑制效率最高;Western blot检测显示其对3个前列腺癌细胞株中SHARPIN表达抑制效率均达70％以上.当SHARPIN被抑制后,p65的激活明显受抑,15 min时对p-p65抑制率达95.0％;Survivin的表达比对照组明显下调,加入NF-κB抑制剂后,Survivn表达量虽然也明显下降,但是远没有抑制SHARPIN后表达量下降的明显.抑制SHARPIN后,LNCap、DU145和PC-3的增殖抑制率分别为31.0％、56.8％和54.6％.抑制SHARPIN后,3种前列腺癌细胞早期凋亡明显增加.结论 SHARPIN可以通过NF-κB通路抑制前列腺癌细胞凋亡;Survivin可能是其并不唯一的下游调控因子.

摘要：背景:骨髓干细胞能够修复受损心肌,改善不利的心室重构及恶化的心功能,但细胞移植后对梗死心室重构影响的分子机制仍不清楚。目的:观察骨髓单个核细胞心肌移植后,心肌组织NF-κB、基质金属蛋白酶及其抑制因子表达的变化。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-07/2007-05在解放军总医院心血管外科实验动物中心和解放军军事医学科学院病原微生物生物安全国家重点实验室完成。材料:成年健康雄性杂种犬24只,随机分为急性心肌梗死对照组、急性心肌梗死移植组、陈旧心肌梗死对照组、陈旧心肌梗死移植组,6只/组。方法:急性心肌梗死对照组、急性心肌梗死移植组在冠状动脉左前降支主干结扎1h,观察缺血梗死区仍然呈暗红色,确认急性心肌梗死模型建立成功。陈旧心肌梗死对照组、陈旧心肌梗死移植组在移植前行超声心动图检查,证实左室前壁和心尖部可见节段性室壁运动异常,确认陈旧心肌梗死模型建立成功。Ficoll分离法获得犬自体骨髓单个核细胞悬液,急性心肌梗死移植组在造模后1h于梗死区及梗死边缘区分多点注射细胞悬液,每点注射0.5mL,(1～2)×107个细胞/mL;陈旧心肌梗死移植组于造模后4周开胸确认梗死区,同法行细胞移植。主要观察指标:RT-PCR法检测心肌组织基质金属蛋白酶及其抑制因子mRNA的表达,Western免疫印迹法检测心肌组织NF-κB的表达。结果:移植后6周与相应对照组比较,急性心肌梗死移植组、陈旧心肌梗死移植组的梗死区、梗死周围区基质金属蛋白酶2,9mRNA及NF-κB表达均显著降低(P<0.01),基质金属蛋白酶抑制因子1,2mRNA表达均显著升高(P<0.01)。结论:犬自体骨髓单个核细胞心肌移植可能通过抑制NF-κB活化,导致基质金属蛋白酶mRNA表达减少及其抑制因子mRNA表达增加,从而抑制梗死后心室重构过程。

摘要：目的　建立实验犬心肌组织细胞核转录因子 (NF -κB)快速提取及鉴定方法。方法　采用液氮快速冷冻使犬心肌组织破碎 ,并优化核蛋白提取鉴定条件 ,参考哺乳动物鼠Igκ轻链基因 ,设计可与犬心肌细胞核转录因子结合的序列 ,在不同的提取和标记条件下 ,通过凝胶阻滞分析NF -κB活性。结果　两种提取及标记条件 ,凝胶阻滞分析结果有明显不同。按优化实验的方法提取和标记NF -κB ,实验结果更为理想。结论　优化提取条件后 ,提取犬心肌细胞NF -κB的方法简便、快速 ;设计的特异DNA探针可与犬心肌组织细胞NF -κB特异结合并显示良好的结合活性 ,为实验犬在急性事件时其心肌组织细胞NF -κB活性的研究提供了可行方法。

摘要：目的为进一步研究核转录因子(PAX2)对肾小管上皮细胞的转分化调控机制提供依据。方法真核表达质粒(PGC-FU)-PAX2真核表达质粒的构建:设计PAX2的引物,PCR法从单侧输尿管结扎大鼠肾脏中扩增出目的片段,酶切后定向连入PGC-FU载体,将该重组质粒转化到Ecoli感受态细胞中,通过氨苄青霉素抗药性筛选出成功转化的阳性克隆,并进行扩增;通过PCR及基因测序检测其构建的正确性;PGC-FU-PAX2瞬时转染肾小管上皮细胞模型的建立:脂质体转染法将重组质粒转入肾小管上皮细胞(NRK52E细胞),RT-PCR法、Western blot法分别检测NRK52E细胞PAX2基因、蛋白表达水平,确认PAX2基因的高表达。结果 RT-PCR法成功克隆大鼠PAX2基因,PCR扩增的片段长度为1 294 bp,含有重组质粒的阳性克隆菌液PCR扩增片段约为408 bp,其基因测序结果显示与预期片段大小一致,目的基因与预期基因序列的同源性为100%,说明PGC-FU-PAX2真核表达质粒构建成功。NRK52E转染的PGC-FU-PAX2质粒能够高表达PAX2,呈现绿色荧光,空载组和对照组NRK52E均未见PAX2高表达。结论成功构建了真核表达载体PGC-FU-PAX2,建立了PAX2高表达肾小管上皮细胞模型,为PAX2对肾小管上皮细胞的转分化作用机制的研究奠定了实验基础。

摘要：目的 :构建可以与酵母染色体组发生重组的质粒 pHis_NF和 pLacZ_NF。 方法 :人工合成44bp的三重NF_κB元件寡聚核苷酸 ,通过DNA重组技术将靶序列NF_κB串定向插入细菌_酵母穿梭质粒pHisi和pLacZi的多克隆位点MCS后 ,用特异性酶切、琼脂糖凝胶电泳、PAGE电泳、DNA测序等方法进行鉴定。 结果 :PAGE电泳和DNA测序分析证实定向插入的寡聚核苷酸串与预先设计的插入序列一致。 结论 :成功地构建了重组质粒 pHis_3NF和 pLacZ_3NF ,为借助酵母单杂交实验技术平台深入探讨NF_κB因子相关基因的转录调控机制奠定了实验材料和技术基础。