摘要：槟榔是海南省重要的热带经济作物,由植原体侵染引起的槟榔黄化病(areca palm yellow leaf disease,YLD)是当前我国槟榔生产上的一种毁灭性病害。为了建立精准高效的槟榔黄化植原体检测方法,本研究基于槟榔黄化植原体16SrDNA基因,设计并合成特异性引物AMf/AMr和探针AM-Prode,使用该方法进行准确性、敏感性、特异性及重复性测试,并在其他植物的植原体病害进行检测。结果显示:本检测方法能够准确的检测出阳性样品,健康样品无扩增曲线;在敏感性测试中,该检测方法能检测到1.16×10^(1) copies/μL样本浓度水平,其标准曲线方程为y=-3.4185x+43.624,扩增效率为96.12%,相关系数R^(2)=0.9833;在特异性测试中,该检测方法对YLD的检测具有较好的特异性,槟榔、槟榔其他病害病原及其内生菌的基因组对本方法未造成干扰;在重复性测试中,该检测方法对槟榔黄化病的检测具有较好的重复性;并且该检测方法可对苦楝黄化病、细圆藤丛枝病及辣椒黄化病等8种植原体病害进行检测,对植原体的检测具有一定的通用性。本检测方法的建立,有利于为槟榔黄化病的精准诊断、病原监测及媒介昆虫的检测等研究提供可靠的技术手段。

摘要：槟榔黄化病是由植原体引起的致死侵染性病害,严重制约海南省槟榔产业发展。为了提高槟榔黄化植原体的检测效率,本研究设计了新的巢氏PCR引物:F4/R1和F2/R2,并利用该引物检测海南省300份槟榔黄化叶部样品,其中184份呈阳性,比植原体通用引物(R16mF2/R16mR1和R16mF2n/R16mR2)检测率提高了58.00%。利用新引物首次在槟榔种果中检测到植原体。将本研究扩增的约1.2 kb的特异性片段测序,并进行序列比对和系统进化树分析。结果显示,该槟榔黄化植原体属于16SrI组,且与16SrI-M序列完全一致。此外,本研究所测序的槟榔黄化植原体(GenBank登录号:MZ971180)与已知的海南省槟榔黄化植原体(GenBank登录号:FJ694685;FJ998269)分别存在两个碱基差异,序列一致性为99.80%。本研究为槟榔黄化病诊断及防控提供理论依据。

摘要：【目的】建立一种能够特异性检测和鉴定16SrⅠ组植原体的环介导恒温扩增技术,实现16SrⅠ组植原体的快速检测。【方法】以植原体tuf基因作为靶标,通过序列比对,设计多组具有特异性的LAMP引物组,筛选出一套适用于16SrⅠ组植原体的特异性检测体系。以16SrⅡ组、16SrⅤ组、16SrⅩⅨ组植原体样品按照此检测体系进行反应,来验证其特异性;同时将稀释后的感病组织样品同步进行PCR和LAMP检测,以确定其检测灵敏度。对来自不同省市的6份田间样品以及9份组培样品进行检测,以验证其检测的稳定性。【结果】16SrⅠ-LAMP在恒温63℃条件下40 min内完成扩增,能检测5种分别引起泡桐丛枝、苦楝丛枝、桑树萎缩、莴苣黄化和长春花绿变病的16SrⅠ组植原体,不能检测其他组植原体包括16SrⅡ组的花生丛枝、甘薯丛枝、臭矢菜丛枝、16SrⅤ组的枣疯病、红花槐丛枝、樱桃致死黄化和16SrⅩⅨ组的板栗黄化皱缩植原体。通过在反应液中加入钙黄绿素肉眼判断绿色为阳性结果,褐色为阴性结果,与用荧光定量设备进行判读扩增曲线的结果一致。相比于PCR检测,16SrⅠ-LAMP检测的灵敏度提高了8倍;16SrⅠ-LAMP能够快速检测出来自不同区域的田间泡桐发病样品、感病泡桐组培苗和嫁接传病脱毒苗。【结论】以tuf基因作为靶标,建立能同时检测5种16SrⅠ组植原体的环介导恒温扩增技术,具有高效、特异、操作简便、检测时间短及成本较低等优点,适合于基层和现场检测。

摘要：本研究成功建立了植原体分类鉴定和检测的 Taq Man探针实时荧光 PCR方法 ,该方法根据植原体 16S r DNA保守区设计了 1个 Taq Man广谱探针和 3个植原体组间点突变特异性探针 ,并对 9种植原体和 5种细菌以及 3个植物样本进行实时荧光 PCR。结果表明 ,用广谱探针可检测到所有植原体产生荧光信号 ,而细菌不产生荧光信号。当用植原体组间特异性探针检测时 ,仅能检测到该组植原体产生荧光信号 ,检测的敏感性比常规的 PCR-电泳检测高约 10 0倍、检测速度有较大提高。由于PCR产物是荧光探针检测 ,本方法特异性强 ,并可以用组特异探针直接确定植原体种类。实验采用完全闭管检测 ,降低了污染机会。本研究为其它原核生物、特别是不能培养菌。

摘要：为建立简便、快速、特异性的甘蔗白叶病植原体检测方法,本研究根据甘蔗白叶病植原体secA基因设计特异引物secA-F/secA-R,建立了甘蔗白叶病植原体PCR检测方法。使用该方法可以从含有甘蔗白叶病植原体的甘蔗样品中稳定扩增出目标基因片段,片段长度为350 bp。本方法的最低检测浓度为50 fg/µL。应用该方法对云南耿马蔗区采集的7份甘蔗白叶病样品进行了检测鉴定,结果表明,所有样品均为阳性。以上结果表明,本研究建立的甘蔗白叶病植原体PCR检测方法特异性和敏感性好,操作简便,适用于甘蔗白叶病植原体的快速检测。

摘要：小麦蓝矮病是陕西乃至西北冬麦麦区的一个重要病害,由介体条沙叶蝉专化性传播.对小麦蓝矮病株叶片和带毒条沙叶蝉进行超薄切片及电镜观察,在叶片韧皮部和叶蝉后肠中均观察到大量典型植原体.利用植原体16S rDNA基因保守序列通用引物对Rm16F2/Rm16R1,应用PCR技术从小麦蓝矮病株叶片中扩增到1.4kb的特异片段.通过对16S rDNA基因片段序列同源性比较,结果表明小麦蓝矮病病原与三叶草绿变、翠菊黄化、绣球花绿变、草莓矮化和番茄巨芽植原体亲缘关系较近,其同源率为99.2%～99.9%.据此可以判定小麦蓝矮病植原体是属于植原体16SrⅠ组,确定了其分类地位.

摘要：根据报道的泡桐丛枝植原体(Paulownia witches'-broom phytoplasma,PaWB)抗原膜蛋白(antigenic membrane pro-tein,AMP)基因的核苷酸序列设计引物,提取发病泡桐总DNA,经PCR扩增并成功克隆泡桐丛枝植原体amp基因。序列分析表明,amp基因由696个核苷酸组成,编码231个氨基酸残基,与GenBank中登录的2个泡桐丛枝植原体的膜蛋白核苷酸序列同源性为100%。将amp基因91-604 nt部分序列(命名为ampd)克隆到原核表达载体pGEX-4T-3,诱导后,经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,表明融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了高效表达。以纯化的带GST标签的AMPD融合蛋白为抗原免疫德国大白兔,制备了PaWB-AMPD抗血清。利用该血清,通过Western印迹、点印迹、ELISA、间接免疫荧光和免疫捕获PCR试验均能在发病泡桐组织中特异检测到泡桐丛枝植原体。

摘要：植原体病害是严重危害农业生产的一类植物病害,早期检测是预防植原体病害的主要途径之一。利用基因芯片检测技术能够实现高通量、快速检测植原体病原。本研究通过分析比对11种植原体16S rDNA序列,设计并合成相应的特异性探针,进一步制备了植原体检测基因芯片,并利用所制备的基因芯片对发病桑树植株进行了检测,检测结果表明本实验室制备的植原体检测基因芯片具有较高的特异性,为植原体检测基因芯片技术的推广应用奠定了基础。

摘要：葡萄上的植原体病害由于引起叶片黄化而被称为葡萄黄化病。由于这一病害极为严重,葡萄黄化植原体被列为我国的植物检疫对象。其中,葡萄金黄化植原体(16SrV)、维吉尼亚葡萄黄化植原体(16SrⅢ)和澳大利亚葡萄黄化植原体(16SrⅫ)是引起葡萄黄化病的主要3个株系,它们导致的病害症状相似,难以区分。本文进行了3个株系16S rRNA基因DNA序列比对,而后根据同源性相对低的序列设计了43条特异性引物、103对引物对组合,对葡萄黄化植原体3个株系各自的DNA及混合DNA进行PCR扩增,从中筛选出来特异性较强的8个引物对组合。这些引物对组合,能够同步、特异、快速地检测3种葡萄黄化植原体。

摘要：根据枣疯病植原体16SrDNA基因保守序列,设计出4条特异性环介导等温扩增(LAMP)引物。通过对反应条件的优化,建立一种适用于枣疯病植原体的可视化LAMP检测技术,对优化后的方法进行特异性、灵敏度评价。结果显示,该方法能够特异性地检测出枣疯病植原体,且LAMP产物的特异性通过MaeⅡ酶切得到验证;灵敏度较常规PCR高出100倍;并可通过肉眼观察反应液颜色变化,直接判定结果。建立的枣疯病植原体LAMP可视化检测方法适用于基层及现场快速检测,为枣疯病的快速检测提供了新方法。