摘要：青岛海葵中存在两种具有增强心肌收缩功能的多肽类毒素 (分别命名为Ap QD1和Ap QD2 ) .通过分析已经得到Ap QD2的氨基酸序列 ,按照毕氏酵母的偏爱密码子设计并合成了Ap QD2的cDNA .将合成cDNA序列通过PCR扩增及一系列分子克隆操作导入毕氏酵母表达载体 pPICZαA中 ,以电穿孔方法转化毕氏酵母GS115和KM71,并进行转化子的表型及高拷贝化筛选 .其中的KM 71(Muts)的转化子经摇瓶发酵 ,每升发酵液可表达约 2 0mg的重组Ap QD2产物 ,通过纯化可得到 7mg纯的有天然生物学活性的Ap QD2基因工程产物 .

摘要：目的 在甲醇营养型毕氏酵母蛋白质表达系统中高效表达人白细胞介素-11（ rhIL-11），便于进一步开发。方法 以人工设计合成的 rhIL-11基因，构建表达载体 pPICZα A-IL-11，经线性化后电转化导入毕氏酵母菌株 KM71，甲醇诱导表达，用 ELISA和 SDS-PAGE检测发酵上清中 IL-11的抗原性和表达量，用 IL-11依赖的 B9-11细胞株分析其生物学活性，采用疏水层析、离子交换和凝胶过滤纯化发酵上清中的 IL-11。 结果 序列分析表明，克隆载体中 IL-11人工基因序列与设计相符；基因工程菌株 KM71-2424在摇瓶培养上清中 IL-11的表达量超过 60 mg/L，生物学活性测定显示其比活性为 5.5× 107 U/mg，而标准品的生物学活性为 2.2× 107 U/mg。经过三步层析纯化得到电泳纯的 rhIL-11蛋白质。结论 成功获得 IL-11人工基因和稳定分泌重组蛋白的基因工程菌株 KM71-2424，该重组蛋白的生物学活性显著高于大肠杆菌表达的标准品，并获得较高纯度的重组蛋白。

摘要：对早先建立的甲醇营养型重组毕氏醇母(Pichiapastoris)结构模型的产物生成部分进行了动态改进.甲醇流加初期蛋白生成所需的酶系尚处于诱导期,为了描述该酶系浓度和活性从低到高对产物比生成速率的影响,引入了一阶闭环调节器模型加以逼近,同时考虑了细胞体积增大对胞内酶系浓度的稀释作用.设计了6次实验以验证模型的有效性.结果表明,该模型能对细胞生长和蛋白生成给出满意的描述,同时,各罐批间参数变化不是很大,表明该模型具有较强的鲁棒性.

摘要：采用PCR方法,根据文献报道的人成骨蛋白（osteogenic protein-1,OP-1）成熟肽基因序列,设计并合成一对引物,从构建的含人成骨蛋白基因的质粒中扩增获得大小为420bp的DNA片段,连接到pGEM-T载体进行测序,证明获得人成骨蛋白成熟肽基因片段,并以pPIC9K为表达载体构建重组表达质粒,转化大肠杆菌细胞,经鉴定的阳性重组质粒并线形化,电转化毕氏酵母细胞GS115,于30℃进行甲醇诱导分泌表达,表达产物存在于培养基中,占分泌蛋白的10％.重组表达产物进行Western Blot可以检测到重组表达产物,ELISA检测其具有特异性结合活性.

摘要：目的　在甲醇营养型毕氏酵母蛋白质表达系统中高效表达重组人白介素 - 13(rhIL - 13) ,便于进一步研究开发。方法　根据酵母对密码子的偏爱性设计并人工合成了人IL - 13编码基因片段 ,经T4DNA连接酶、PCR技术连接形成IL - 13cDNA全长序列 ;将其插入 pPICZαA质粒中 ,构建成 pPICZαA -IL - 13表达载体 ;该载体经SacI线形化后以电转化法导入GS115酵母菌株中 ,经YPD平板Zeocine抗性筛选获得IL - 13表达阳性菌株 ;用WesternBlotting和ELISA检测发酵上清中IL - 13的抗原性和表达量 ,B9-11细胞株分析其生物学活性。结果　15 %SDS -PAGE显示重组人IL - 13分子量约 13kd ,Western -blotting证实为人IL - 13,ELISA测定在摇瓶培养上清表达量达 15 μg/ml,其生物学活性同标准品一样具有剂量依赖性的刺激B9-11细胞株增殖的作用。结论　成功获得IL - 13人工基因和稳定分泌蛋白的基因工程菌株 ,该重组蛋白的生物学活性达到标准品的要求。

摘要：根据Ovis aries interleukin(IL-2)序列设计1对引物,用PCR法扩增的目的基因进行克隆,将测序正确的IL-2基因片段和表达载体pPIC9K同时双酶切后相连,构建pPIC9K-IL-2重组表达载体.将线性化的载体pPIC9K-IL-2电转化毕赤酵母GS115,对重组酵母转化子经MD平板筛选和PCR分析鉴定后,用G418(4g/L)筛选到多拷贝菌株,进行不同条件下甲醇诱导表达.结果表明:经PCR鉴定IL-2基因已整合到酵母基因组中,表达产物经SDS-PAGE电泳分析发现相对分子质量约为18ku目的蛋白表达条带,本研究成功构建了高效表达重组羊IL-2毕赤酵母菌株,为新型细胞因子佐剂的研发奠定了基础.

摘要：目的 :研究日本血吸虫大陆株副肌球蛋白基因第 3区域片段 (Sjc- 97f3)毕氏酵母表达产物的免疫原性。方法 :根据毕氏酵母密码子使用频率重新设计 Sjc- 97核苷酸序列 ,依据不对称 PCR原理人工合成 Sjc- 97f3,并在毕氏酵母中表达。表达产物通过 Ni- NTA亲和层析和凝胶过滤层析方法纯化 ,再分别与 ISA72 0和 Al(OH) 3佐剂乳化后 ,免疫 C5 7BL/ 6和昆明小鼠 ,通过尾蚴膜反应和 EL ISA反应检测特异性抗体。 结果 :Sjc- 97f3基因在毕氏酵母中获得了高水平分泌表达 ,其表达产物能与日本血吸虫免疫血清进行特异性免疫反应。经与佐剂乳化后 ,该蛋白具有良好的免疫原性。EL ISA结果显示重组蛋白在小鼠体内可激发明显的抗体反应 ,但 2种佐剂所诱导的抗体水平以 ISA72 0佐剂为高 ;该抗原在不同品系小鼠中的抗体水平存在显著差异 (P<0 .0 1 ) ,昆明鼠的抗血清滴度远高于 C5 7BL/ 6小鼠。小鼠免疫血清能识别日本血吸虫表面抗原 ,产生特异的尾蚴膜反应。结论 :密码子优化的 Sjc- 97f 3在毕氏酵母中获得高效表达 。