摘要：目的建立一种基于微流控芯片平台的可同时鉴别沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)、淋球菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)、解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum,UU)的现场化全自动检测方法。方法选取CT的隐蔽性质粒、NG的porA基因和UU的16SrRNA中的保守序列作为检测靶标,设计特异性引物和TaqMan探针;分别制备CT、NG、UU三种病原体的阳性克隆菌株进行灵敏度初步测试。开发基于全自动检测设备的一体化微流控芯片,实现“样本进-结果出”的核酸提取纯化及实时荧光PCR全过程。使用经过数字PCR定量的CT、NG、UU三种病原体的液体室内质控品对全自动检测方法的灵敏度、特异性和重复性进行评价。用建立的全自动检测方法与已上市的多重实时荧光PCR法检测试剂盒同时检测160例临床样本,评价其一致性。结果阳性克隆菌株经琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定,构建正确。建立的全自动检测方法检测CT、NG和UU的检出限均可达到1×10^(2) copies/test,检测范围1×10^(2)~1×10^(7) copies/test;该方法特异性好,不受单纯疱疹病毒Ⅰ型/Ⅱ型、腺病毒、肠道病毒71型、肺炎衣原体、肺炎支原体以及人免疫缺陷病毒Ⅰ型的干扰;该方法重复性好,变异系数均0.05);全自动检测方法与对比试剂盒检测CT、NG和UU结果的阳性符合率分别为96.2%、94.4%和93.4%,阴性符合率均为100%,总符合率分别为99.4%、99.4%和97.5%。结论建立的现场化全自动检测方法具有良好的灵敏度、特异性和重复性,该方法自动化程度高,检测时间短,操作简便、快速,不受实验室场地限制,适合于CT、NG、UU的临床快速诊断。

摘要：目的 对沙眼衣原体（Ct）主要外膜蛋白（MOMP）细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位进行预测和选择，并进行Ct MOMP多表位基因克隆和多表位蛋白的原核表达及其抗原性分析，为研制多表位Ct疫苗提供基础资料。方法利用SYFPEITHI法和多项式方案结合预测HLA-A2限制性的0MOMP的CTL表位，选取含多个CTL表位的基因片段作为目的基因，兼顾目的基因上下游存在的TH和B细胞表位的基因，共同组成含CTL、TH和B细胞表位的多表位基因。多表位基因经密码子优化后进行全序列合成，克隆入原核表达载体pET-32a（＋），经IPTG诱导在大肠杆菌BL21（DE3）表达并纯化，经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物。结果 经预测筛选得到了多个MOMPHLA-A2限制性的CTL表位，成功克隆了含CTL、TH、B表位的MOMP多表位基因，并在大肠杆菌中获得了高效表达。表达产物的相对分子质量（Mr）约24×10^3，与预期肘，相符，并用Western blot方法初步证实多表位蛋白有抗原特异性。结论 成功设计了Ct MOMP的T、B细胞多表位基因，并证实在原核表达系统中获得正确表达的多表位蛋白具有良好的抗原性。

摘要：为建立基于TaqMan MGB探针的沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测方法 ,探讨其临床应用价值 ,用PCR法扩增沙眼衣原体隐蔽质粒pLVG44 0 2 464～ 2 980nt段 ,并克隆入 pMD18 T载体用作参比模板 ,设计一对引物和一个TaqMan MGB探针 ,优化反应条件 ,建立沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测系统 ,并运用该系统同时应用连接酶链式反应 (LCR)法对临床标本进行检测 .结果显示所建立的沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测系统 ,最低检测限度为 1DNA拷贝每反应 ;在 10 0 ～ 10 9DNA拷贝每反应范围内 ,Ct 值 (每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数 )和DNA拷贝数呈线性关系 (r >0 990 ) ;对临床标本检测结果同LCR分析结果吻合率为 10 0 % .以上结果表明 ,所建立的基于TaqMan MGB探针的沙眼衣原体DNA荧光定量PCR检测系统具有敏感性高、特异性强和线性检测范围广等特点 。

摘要：目的调查输血传播病毒(TTV)在沙眼衣原体感染者中的感染状况,探讨TTV的传播途径。方法2003年1月至2004年6月新疆维吾尔自治区人民医院等2家医院在TTVORF1保守区设计引物,建立套式聚合酶链反应(PCR),检测46例沙眼衣原体感染者和34例普通体检人群血清、宫颈分泌物中TTV-DNA。结果在46例沙眼衣原体感染者血清、分泌物中TTV-DNA阳性率分别为34·8%、32·6%,而普通体检人群血清、分泌物TTV-DNA阳性率为6·3%、3·1%,两组比较差异有非常显著性意义(P(0·01)。结论沙眼衣原体感染者是TTV感染的高危人群,性接触是TTV传播的重要途径之一。

摘要：本研究根据Ct Ahpc基因序列设计特异性引物,以Ct DNA为模版PCR扩增Ahpc基因到大小为585 bp,将其连接到p ET28a获得重组质粒p ET28a-Ahpc,将该质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌BL/p ET28a-Ahpc,利用IPTG诱导重组Ahpc蛋白表达,目的蛋白分子量大小约为26 k D。利用Ni-NAT亲和层析法纯化得到的重组Ahpc蛋白。氧化铁二甲酚橙法检测发现Ahpc蛋白能够分解双氧水和叔丁基过氧化氢,具有分解过氧化合物的活性。测定重组大肠杆菌在百草枯所致氧化胁迫下的生长曲线,发现表达Ahpc蛋白的重组菌的生长情况比对照好。本研究成功表达和纯化得到沙眼衣原体Ahpc蛋白并测定其活性,为解析沙眼衣原体的抗氧化机制提供实验证据。

摘要：目的:鉴定沙眼衣原体pORF5质粒蛋白的免疫原性,并进一步筛选和确定pORF5质粒蛋白免疫优势片段。方法:以沙眼衣原体D血清型DNA为模板,设计pORF5基因全长和9个不同片段特异引物进行PCR扩增,PCR产物经Bam HⅠ、NotⅠ双酶切后插入经同样双酶切的原核表达载体pGEX-6p中,构建pORF5质粒蛋白不同长度片段的原核表达重组体,重组体经PCR和测序鉴定后,转化XL1 Blue大肠杆菌表达10种不同长度的GST融合蛋白;ELISA方法检测pORF5质粒蛋白的免疫原性,Western blot鉴定pORF5质粒蛋白的免疫反应性;ELISA测定10个不同片段与沙眼衣原体生殖道感染患者血清、鼠免疫血清以及抗pORF5单克隆抗体的免疫反应性,鉴定pORF5质粒蛋白免疫优势片段。结果:pORF5质粒蛋白免疫原性强,能刺激机体产生高效价抗体;破坏pORF5质粒蛋白天然空间结构,其免疫反应性基本消失;在ELISA反应中,N端缺失66氨基酸的F6片段的免疫反应强度与pORF5全长基本相似,F2与F3出现较弱的免疫反应,其余片段免疫反应消失。结论:pORF5质粒蛋白为构象依赖性免疫优势抗原,其免疫优势表位和构象表位位于C端,本研究为进一步探讨pORF5质粒蛋白的生物学功能和疫苗的研制提供实验依据。

摘要：沙眼衣原体是一种严格细胞内寄生的病原体,也是最常见的性传播疾病病原体,可感染人类多个系统引起多种疾病而影响人类健康。沙眼衣原体具有独特的发育周期,黏附和入侵宿主细胞是它感染过程中的关键步骤,首先通过与宿主细胞的静电作用达到简单吸附,随后由自身黏附素分子与宿主细胞相应受体结合达到不可逆结合,而后通过分泌毒力因子劫持宿主细胞骨架的必需成分或信号通路内化入胞。病原体和宿主因素共同参与沙眼衣原体黏附和入侵过程,掌握黏附和入侵过程中有关的细菌和宿主因素有望设计针沙眼衣原体的抗菌策略。本文从宿主和病原体两个方面阐述沙眼衣原体黏附和入侵宿主相关机制。

摘要：【目的】用荧光PCR(fluorescencePCR ,F PCR)方法研制沙眼衣原体 (chlamydiaTrachomatis,CT)DNA检测试剂盒 ,通过临床验证考核其性能 ,并与其它方法比较。【方法】设计合成了CTF PCR诊断试剂盒。检测了 5 16份临床分泌物标本 ,以McCoy细胞培养法和Abbott公司的LCx试剂盒为对照。【结果】阳性率 2 1 1% ,灵敏性 98 2 % ,特异性 99 8%。【结论】F PCR显著优于培养法 ,与LCx相当。F PCR试剂盒可以检测CT的真实感染情况 ,对于临床诊断和疗效考察有一定的指导意义。

摘要：目的研究沙眼衣原体基因转录调控过程中转录激活因子GrgA与RNA聚合酶(RNAP)β'亚基相互作用的关系。方法制备沙眼衣原体RNA聚合酶(cRNAP)NH-β'(N末端携带His标签)质粒:根据GenBank中的基因序列设计特异性引物,以衣原体基因组DNA(gDNA)为模板,聚合酶链式反应技术(PCR)扩增cRNAPβ'亚基的基因片段;采用同源重组法将基因片段插入到目的载体上构建表达质粒,同样方法制备β'亚单位和缺失亚单位质粒;cRNAPβ'亚基蛋白(包括亚单位和缺失亚单位)的表达:将构建的质粒转化ArcticExpress表达菌中,采用考马斯亮蓝染色法鉴定蛋白表达情况;cRNAPβ'亚基及其亚单位蛋白的纯化:采用固定化离子亲和层析法(IMAC)纯化得到相应蛋白;借助体外蛋白结合实验(Pull-down技术)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白质印迹法(Western blot)分析鉴定出GrgA与cRNAPβ'亚基两者间相互结合的较为详细的某一段氨基酸序列。结果GrgA能与cRNAP的β'亚基结合;GrgA与cRNAP的β'亚基N端的(1-731)氨基酸序列有结合,与C端的(671-1396)氨基酸序列无结合。GrgA与β'亚基的(1-240)和(181-417)氨基酸序列有结合;与β'(360-598)、β'(533-731)氨基酸序列无结合。GrgA与β'△(1-180)和β'△(241-417)有结合,与β'△(1-417)无结合。结论GrgA能与cRNAP的β'亚基结合;cRNAP的β'亚基与GrgA的结合存在2个结合位点,分别位于β'亚基N末端的1-180和241-417位氨基酸序列。

摘要：本研究于国内首次建立了人乳头瘤病毒／沙眼衣原体两对引物ＰＣＲ技术，即ＨＰＶ／ＣＴ双重引物ＰＣＲ。将设计在人乳头瘤病毒（Ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｏｍａｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ）１６型早期基因Ｅ１保守区的一对共有引物和设计在沙眼衣原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ，ＣＴ）隐蔽质粒区的一对引物同时加入同一反应体系，一次反应可同时检出泌尿生殖道标本中存在的ＨＰＶ和ＣＴ的单独或混合感染；对设计的两对引物做了敏感度、特异性试验。结果表明，０．１ｆｇＨＩＺＰ－ＨＰＶＤＮＡ及１～２个拷贝的沙眼衣原体即可被检出，且只对ＣＴＬ２ＥＢ血清型及ＨＰＶ６、１１、１６、１８型ＤＮＡ有扩增产物出现，而对人基因组ＤＮＡ、ＨＣＭＶＤＮＡ、ＨＳＶ－２ＤＮＡ、大肠杆菌Ｍ１０９ＤＮＡ、奈瑟氏淋球菌ＡＴＴＣＣ２９４０２ＤＮＡ、解脲支原体Ｔ８ＤＮＡ无扩增产物；并用该方法对２９例临床标本（１８例尖锐湿疣、１１例宫颈癌）中的ＨＰＶ和ＣＴ感染进行了检测，同时用ＨＰＶ多重引物ＰＣＲ对２９例病理确诊后标本中ＨＰＶ感染进行了对比检测；用ＣＴ－ＭＯＭＰ蛋白基因区单重引物ＰＣＲ对１８例尖锐湿疣的ＣＴ感染进行了对比检测。结果表明，ＨＰＶ和ＣＴ相应的两种检测方法的检测?