摘要：为探讨沼泽型水牛NANOG基因的表达调控模式,本研究扩增克隆了广西本地沼泽型水牛NANOG基因的5′调控序列片段,设计了-1 213、-745、-425和-312bp 4个缺失体片段,分别构建成EGFP报告载体。应用显微注射报告载体生产转基因水牛和猪胚胎,并转染水牛胎儿成纤维细胞。结果发现,EGFP的表达仅限于水牛囊胚内细胞团。各缺失体在猪4.5d胚胎中均能启动下游EGFP的表达,转录活性两两之间差异均极显著,按活性从大到小依次为-745、-425、-1 213和-312bp。各缺失体报告载体转染水牛成纤维细胞48h后均可见少数细胞发光,其中-425bp活性极显著高于其他缺失体,-1 213与-745bp之间无显著差异,二者均极显著高于-312bp。以上结果说明,水牛NANOG基因翻译起始位点上游-1 213bp在水牛囊胚中可以调控NANOG在内细胞团中的特异性表达;-1 213～-745bp含有多能细胞特异性的抑制子元件;-745～-425bp含有多能性细胞特异性的增强子元件;-425～-312bp含有非多能细胞特异性的增强子元件。

摘要：【目的】克隆沼泽型水牛VASA基因5′侧翼序列,对启动子进行生物信息学分析及转录活性检测,为后续水牛繁殖性能的分子机理研究奠定基础。【方法】根据GenBank已公布的河流型水牛(Bubalus bubalis)的VASA5′侧翼序列,经过同源比对,设计PCR引物。以沼泽型水牛血液基因组为模板扩增VASA基因5′侧翼序列并进行测序和生物信息学分析。将扩增的VASA基因5′侧翼片段插入pEGFP-1多克隆位点处,构建pVASA-EGFP-1载体。载体经脂质体转染HEK-293T和CHO细胞系,分析其转录活性。【结果】成功克隆沼泽型水牛VASA 5′侧翼序列及部分CDS区序列,共3 081bp,同源性分析表明,沼泽型水牛VASA基因5′侧翼序列与河流型水牛、黄牛、绵羊、山羊、小鼠和人的相似性分别为99%,96%,93%,95%,90%和79%。对其5′侧翼序列2 000bp进行启动子预测及转录因子结合位点预测,发现在其翻译起始位点上游-635--586处存在TATA box,启动子区存在Nobox、Stat1、Stat3、Stat4、Stat5a、Stat5b、Stat6、Gata3、Smad2、Smad3和Smad4等反式作用因子结合位点,其中Stat家族基因在VASA启动子区存在多个结合位点,且同一位点又存在多个Stats基因结合的情况。水牛VASA启动子能启动EGFP在HEK-293T细胞中的表达,但非常微弱;能启动EGFP在CHO细胞中表达,且启动活性与CMV启动子相似。【结论】成功克隆了沼泽型水牛VASA基因启动子,分析了其启动子序列特征并成功验证其组织特异性和转录活性。

摘要：为了研究广西沼泽型水牛瘦素受体(Leptin receptor Lepr)基因的编码区序列和编码蛋白的理化性质,进一步推测该基因的功能,本试验利用RT-PCR技术,根据GenBank中已公布的水牛Lepr基因编码区序列设计一对特异性引物,从广西沼泽型水牛肌肉中扩增Lepr基因编码区序列并进行测序分析,运用生物学软件对其基因的序列以及基因编码产物的结构进行分析。结果表明:成功克隆获得广西沼泽型水牛Lepr基因,编码区长522 bp,可以编码174个氨基酸;CDS区的核苷酸序列与猪、野牛、牛、鹿、绵羊等物种相似,序列的同源性分别为90.8%、92.6%、92.9%、96.2%和96.1%,其氨基酸序列同源性分别为88.6%、89.9%、97.4%、95.3%和94.4%;生物信息学分析发现广西沼泽型水牛Lepr基因在进化上较为保守,构建的进化树表明其与黄牛、绵羊等物种亲缘关系较近。

摘要：从健康沼泽型水牛静脉无菌采血,分离外周血单核细胞(PBMCs),用刀豆素A(ConA)诱导培养3,8和12 h后,提取细胞总RNA,以Oligo(dT)18为引物合成第一链cDNA,根据牛的白细胞介素18(IL-18)和绵羊的肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因序列设计2对特异性引物,通过PCR方法扩增出水牛IL-18和TNF-α基因,将其克隆到pMD18-T载体,测序后进行序列分析。结果试验中所克隆到的IL-18和TNF-α基因序列的开放阅读框(ORF)分别为602 bp和715 bp,与GenBank所登录的水牛IL-18和TNF-α核苷酸序列同源性为99.1%和99.7%,其推导的氨基酸序列同源性分别是99.0%和98.7%。表明成功从水牛外周血中克隆到了水牛IL-18和TNF-α基因。

摘要：分别设计位于CSN3 5个外显子旁侧引物,采用DNA测序法对沼泽型和河流型水牛CSN3编码区结构进行了分析,并对10个水牛群体共106个样本CSN3第4外显子序列进行了变异检测。结果表明,两类水牛CSN3编码区由848个核苷酸组成,包括ORF序列573bp、5′-UTR序列69bp和3′-UTR序列206bp。在水牛CSN3第4外显子中共检测到4个SNP,其中c.445G>A,c.467C>T和c.516A>C为异义替换,导致相应的κ-CN成熟肽中氨基酸发生***128Ile、***135Ile和***151Asp改变,c.467C>T和c.516A>C替换可能对κ-CN功能产生了影响。群体遗传分析表明,在河流型水牛中,等位基因c.445G、c.467C、c.471C和c.516A均为优势等位基因,而在沼泽型水牛中,仅c.445G、c.467C和c.471C为优势等位基因,河流型和沼泽型水牛的遗传差异主要体现在SNP516位点的群体遗传组成上。

摘要：根据GeneBank上发表的牛IL-2基因序列,设计一对引物,采用RT-PCR技术,以ConA刺激培养9h、17h的沼泽型水牛外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出水牛IL-2基因。琼脂糖凝胶电泳显示扩增片段约为724bp,分离纯化,克隆到pMD18-T载体。经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定,以及核苷酸测序结果显示,克隆的水牛IL-2基因与GeneBank上发表的序列同源性为99·8%。

摘要：试验根据已有的哺乳动物FEZL基因序列设计引物,采用PCR产物直接测序技术对河流型与沼泽型水牛共144头水牛(属于10个群体)的FEZL基因第1外显子进行了序列测定和比较分析。结果表明,水牛FEZL基因第1外显子长度为907bp,水牛群体中FEZL基因第1外显子存在1个SNP(c.165G>A),属于同义替换,其buffaloG等位基因在群体中已接近固定;河流型和沼泽型两类水牛群体中FEZL基因第1外显子多个连续的甘氨酸残基编码区都为13G类型;水牛与普通牛、人、小鼠、马、猪和狗的FEZL基因第1外显子序列差异较大,推测水牛的FEZL在功能上可能与普通牛等其他物种存在差异;尽管两类水牛连续的甘氨酸残基编码区都为13G类型,但其可能与水牛乳腺炎易感性无直接关联。研究结果可为水牛乳腺炎的抗病育种提供遗传背景资料。