摘要：非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起家猪和野猪的一种高死亡率的传染性疾病。ASFV具有庞大的基因组,其中非结构蛋白pD1133L被预测为其编码的6个解旋酶之一。本实验室应用免疫沉淀-质谱联用(immunoprecipitation-mass spectrometry,IP-MASS)技术筛选与pD1133L互作的宿主细胞蛋白,发现细胞波形蛋白(vimentin,VIM)为pD1133L互作的宿主蛋白之一,但尚不清楚宿主蛋白VIM对ASFV复制的影响。【目的】探究ASFV与VIM的相互调控作用,揭示VIM促进ASFV复制的机制。【方法】通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)试验验证pD1133L与VIM存在互作关系;外源过表达VIM蛋白以及设计并合成VIM的si RNA探究VIM对ASFV复制的影响;利用Western blotting以及荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)方法检测ASFV对VIM蛋白水平以及转录水平的影响;通过Western blotting、间接免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)探究巨噬细胞感染ASFV后VIM磷酸化水平变化以及亚细胞定位变化情况;CCK-8试剂盒检测VIM磷酸化抑制剂KN-93处理的最佳浓度,并利用Western blotting以及IFA检测KN-93对VIM磷酸化、亚细胞定位以及对ASFV复制影响。【结果】VIM过表达促进ASFV复制,敲低VIM的表达则抑制ASFV复制;ASFV感染抑制VIM蛋白水平以及转录水平表达,且呈时间依赖性;ASFV感染后VIM发生磷酸化修饰且发生亚细胞定位改变,从而促进ASFV复制。【结论】证实了ASFV与宿主蛋白VIM之间的相互调控作用;初步确定ASFV感染后VIM受到ASFV pD1133L调控,亚细胞定位发生重排向核周聚集从而促进ASFV复制的机制。

摘要：为了研究波形蛋白在介导PRRSV感染过程中的作用,根据GenBank中已发表的波形蛋白序列,设计特异性引物,利用RT-PCR方法从Marc-145细胞中扩增目的基因,克隆入pET-28a,转化表达菌BL21(DE3)中进行诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物,将表达产物纯化后免疫BALB/c小鼠制备血清,用病毒阻断实验验证PRRSV与波形蛋白及其抗体的关系。用ELISA方法确定了重组波形蛋白与PRRSV结构蛋白N蛋白和囊膜蛋白GP5蛋白之间的关系。结果表明,成功的从Marc-145细胞中扩增出全长的波形蛋白基因,将其克隆入pET-28a,诱导后得到高效表达,表达蛋白纯化后免疫小鼠抗体效价达到105,病毒阻断实验表明波形蛋白能部分阻断PRRSV感染,其抗血清能完全阻断PRRSV感染。ELISA结果表明波形蛋白能与N蛋白结合而不与GP5蛋白结合。此结果为PRRSV感染的细胞的受体机制增添了新的内容,为PRRSV感染过程中受体间的相互作用关系研究奠定基础。

摘要：为研究波形蛋白(vimentin)对H9N2亚型禽流感病毒(AIV)复制的影响,构建了真核表达载体FLAG-vimentin,并采用Western blot技术验证FLAG-vimentin重组载体和病毒NP蛋白的表达情况,用荧光定量PCR技术检测病毒HA基因水平。同时,设计合成siRNA,敲低内源性vimentin,检测其对病毒HA基因表达水平的影响。构建原核表达载pCold I-vimentin,蛋白纯化后孵育细胞,采用Western blot、荧光定量PCR技术检测病毒的蛋白表达和基因水平的变化。结果证实,H9N2亚型AIV感染FLAG-vimentin重组载体转染的Hela细胞12 h时,病毒NP蛋白表达减少;而在感染24和36 h时,病毒NP蛋白表达上升。荧光定量PCR结果亦显示,在AIV感染后12 h时,HA基因表达水平明显降低。siRNA敲低Hela细胞内源性vimentin后,H9N2亚型AIV的HA基因表达水平在病毒感染12 h时明显升高,24 h时差异较小,36 h时有所升高。纯化后的vimentin重组蛋白孵育细胞,在病毒感染36 h时,H9N2亚型AIV的NP蛋白表达显著被抑制。荧光定量PCR结果亦证实病毒HA基因在AIV感染后36 h时表达水平明显降低。上述结果表明,H9N2亚型AIV在人源Hela细胞上的早期复制中,vimentin能起到一定程度上的抑制作用,且其重组表达蛋白孵育细胞能够阻断H9N2亚型AIV对细胞的感染,为深入研究vimentin抗病毒复制的机制提供了重要的试验依据,同时为开展抗H9N2亚型AIV的药物研发提供了参考。

摘要：背景:骨骼肌损伤后是通过肌卫星细胞的增殖形成新核来生长和修复的,但关于骨骼肌细胞增殖和波形蛋白表达的关系很少报道。目的:探讨骨骼肌细胞增殖与波形蛋白表达的关系以及运动性骨骼肌微损伤后修复的机制。设计、时间和地点:随机对照动物实验,于2007-12/2008-09在湖南师大运动人体科学实验中心完成。材料:健康成年8周龄雄性SD大鼠50只,随机分成对照组和运动后即刻、运动后3h、运动后24h和运动后48h组,每组10只大鼠。方法:运动组大鼠进行重复3d的力竭性离心运动,力竭模型采用跑台运动,速度为16m/min,坡度为-16°,持续运动至力竭,对照组为正常大鼠,未做运动。主要观察指标:运动组分别于运动后即刻,3,24,48h取材,对照组一次性取材,免疫组织化学法检测各组大鼠肱三头肌内侧头不同恢复时相增殖细胞核抗原PCNA的表达和波形蛋白的表达。结果:骨骼肌细胞增殖出现时序性变化,运动后即刻增殖指数显著大于对照组,运动后24h达到峰值,运动后48h增殖指数有所下降。骨骼肌细胞中波形蛋白表达出现时序性,而且其免疫反应分值的时序性与增殖指数出现一致性,但与增殖指数不具有相关性。结论:3d重复性力竭离心运动后骨骼肌细胞增殖和波形蛋白的表达出现时序性变化。波形蛋白的表达与肌细胞增殖具有一定的关系,但不是惟一的影响的因素。

摘要：目的:观察不同中医治法对大鼠肝癌波形蛋白(vimentin,VIM)表达的调控差异,以及VIM在人肝癌细胞增殖中的作用。方法:将84只雄性Wistar大鼠随机分为正常组、模型组以及实验组,除正常组外均采用二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌,实验组分别经中药健脾益气、清热解毒、活血化瘀等治疗,检测各组大鼠肝癌组织(正常组取肝组织)VIM表达的差异;根据人VIM基因编码区设计2个siRNA靶点,并将构建好的重组质粒转染SMMC-7721人肝癌细胞株,Realtime-PCR检测转染前后该基因的表达差异,MTT法检测转染前后细胞生长增殖情况。结果:芯片结果显示,VIM基因在大鼠肝癌形成后表达显著增加(模型组芯片读数为正常组10倍以上),健脾和活血治法明显下调其表达;采用MTT法筛选到一个VIM基因RNA干扰有效靶序列,脂质体转染144 h后细胞的生长增殖得到了明显的抑制;实时荧光定量PCR检测表明,转染72 h后该基因的表达量明显降低(转染效率为50%)。结论:肝癌细胞恶性增殖有赖于VIM基因的高表达,健脾和活血方药能显著下调该基因表达。

摘要：为进一步探索波形蛋白(vimentin)调控绒山羊绒毛生长的作用机制,以内蒙古遗传种子资源阿尔巴斯白绒山羊皮肤中的毛囊组织为材料,利用PCR技术和酵母双杂交技术对根据GenBank中山羊的vimentin蛋白序列,运用蛋白质互作在线软件预测和液相色谱质谱联用采集免疫共沉淀数据筛选出肌动蛋白(ACTB)和vimentin进行基因引物设计、克隆、酵母表达载体构建和蛋白互作鉴定。结果显示:成功克隆出绒山羊vimentin基因CDS区序列的长度为1 401 bp, ACTB基因CDS区序列的长度为1 128 bp;构建了酵母表达载体;试验组共转化pGBKT7-vimentin与pGADT7-ACTB的Y2HGold菌株在二缺板SD/-Trp/-Leu/X-α-GaL/AbA培养基和四缺板SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-GaL/AbA培养基上,均能生长出淡蓝色菌落,而在对照组共转化pGBKT7空质粒与pGADT7-ACTB重组质粒的二缺板SD/-Trp/-Leu/X-α-GaL/AbA培养基上长出白色菌落,表明共转化的pGBKT7-vimentin与pGADT-ACTB重组质粒的下游报告基因Lac被激活,共转化pGBKT7空质粒与pGADT7-ACTB重组质粒的下游报告基因Lac未被激活。提示:vimentin与ACTB两种蛋白间存在相互作用。

摘要：目的以波形蛋白(vimentin)基因为靶基因,构建波形蛋白过表达质粒pc DNA3.1b-Vim。方法在PC12H细胞中抽提RNA,进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),得到c DNA,设计引物将目的基因扩增并进行胶回收,将空载质粒pc DNA3.1b与目的基因片段进行双酶切(分别为EcoRI/Xba I)、连接,构建重组过表达质粒,转化到Top10感受态细胞,经氨苄青霉素筛选挑取阳性克隆,扩大培养,提取质粒,凝胶电泳鉴定并进行测序分析。结果凝胶电泳鉴定及DNA测序分析显示重组质粒pc DNA3.1b-Vim构建成功。结论成功构建波形蛋白过表达质粒pc DNA3.1b-Vim,为研究波形蛋白的生物学功能打下基础。

摘要：目的以波形蛋白基因为靶基因,构建波形蛋白干扰质粒shRNA Vim并验证其干扰效果。方法根据GenBank中大鼠波形蛋白的mRNA序列设计shRNA序列,插入至pSilencer 4.1载体,构建重组质粒,转化到Top10感受态细胞,经氨苄青霉素筛选挑取阳性克隆并进行测序分析。结果DNA测序分析显示干扰质粒shRNA Vim构建成功,免疫印迹法显示该干扰质粒能有效地抑制波形蛋白的表达(P<0.001)。结论成功构建波形蛋白干扰质粒shRNA Vim,为研究波形蛋白的生物学功能打下基础。

摘要：目的探究波形蛋白(Vimentin,VIM)在肝门部胆管癌进展过程中的作用。方法设计可干扰波形蛋白表达的siRNA(siRNA-VIM1、siRNA-VIM2、siRNA-VIM3)及一组阴性对照siRNA-NC,将siRNA转染进入肝门部胆管癌QBC939细胞株内,观察抑制VIM表达后对QBC939细胞克隆数目及细胞分裂的影响;将QBC939细胞接种于裸鼠皮下,成瘤随机分组后将siRNA-VIM组、siRNA-NC组及生理盐水组(Control)每日于瘤体内注射药物干预,15 d后取出各组瘤体测量体积,对各组瘤体进行HE染色验证造模情况并用qRT-PCR法及免疫组织化学染色法(Immunohistochemistry,IHC)检测瘤体内VIM的表达。结果(1)siRNA-VIM1组、siRNA-VIM2组及siRNA-VIM3组与siRNA-NC组相比VIM表达均受到抑制,差异具有统计学意义(P<0.05),其中siRNA-VIM2组效果最好。(2)siRNA-VIM1组、siRNA-VIM2组及siRNA-VIM3组与siRNA-NC组相比,细胞克隆数目以及细胞分裂数目呈现出显著减少的趋势,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)比较各组肝门部胆管癌荷瘤裸鼠的肿瘤体积,siRNA-VIM组肿瘤体积小于Control组和siRNA-NC组,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)qRT-PCR和免疫组化结果显示,与Control组和siRNA-NC组相比,siRNA-VIM组的VIM表达显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)HE染色结果显示,siRNA-VIM组与Control组和siRNA-NC组相比,肿瘤细胞减少。结论抑制VIM表达是抑制肝门部胆管癌进展的机制之一,VIM在肝门部胆管癌的进展中起一定作用,深入研究VIM在肿瘤进展中的机制,对肿瘤的靶向治疗具有重要意义。

摘要：目的研究肝癌细胞miRNA-138(miR-138)通过调控细胞周期蛋白D3(CCND3)、波形蛋白对肝癌细胞的影响。方法利用RT-PCR对肝癌组织及癌旁组织(对照)、4种肝癌细胞系(HepG2、HHCC、HUH7、BEL-7402)及正常肝细胞系HL-7702(对照)的miR-138的mRNA表达进行检测;设计合成miR-138的模拟物(mimics)及抑制剂(inhibitor)。分别将空载体(对照)、miR-138的模拟物及抑制剂转染至HepG2细胞,与相应对照相比,分析miR-138对CCND3、波形蛋白表达及肝癌细胞活力的影响。应用CCK-8法、细胞创伤愈合试验和Transwell细胞迁移试验分别对转染空载体、miR-138 mimics 及inhibitor后的HepG2肝癌细胞增殖及迁移能力进行检测。Western blot检测上调或下调miR-138后miR-138相关靶蛋白CCND3及波形蛋白的表达。结果与相应对照相比,miR-138的表达水平在肝癌组织及肝癌细胞系中明显降低( P <0.01)。当miR-138 mimics转染肝癌细胞后,HepG2细胞的活力降低,创伤愈合能力较弱,迁移能力明显降低( P <0.01),经Western blot检测,波形蛋白和CCND3的表达水平降低( P <0.01)。转染miR-138 inhibitor 后,HepG2细胞的增殖能力升高,肝癌细胞的创伤愈合能力和迁移能力提升( P <0.01),与此同时,波形蛋白和 CCND3的表达水平升高( P < 0.01 )。结论通过调节波形蛋白和 CCND3的表达,miR-138在肝癌细胞的增殖活力、迁移能力的变化机制中发挥重要的作用。