摘要：运用单因素和正交试验设计对洋虫超氧化物歧化酶(SOD)的提取工艺进行了优化研究,得到最优的提取条件为:用m(洋虫粉末):V(抽提液)=1g:13mL的0.13mol/LNaCl溶液在28℃下抽提14h。活性可达38.83U/mL,比活力(以蛋白计)可达123.66U/mg。结果表明,NaCl溶液比传统的磷酸盐缓冲液抽提效果更好,其抽提浓度对SOD的提取结果影响最大;同时得到SOD的最佳热变性温度为60℃,时间为15min。

摘要：为了建立洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系,本实验采用MJ Research OpticonTM 2型实时荧光定量PCR仪,利用SYBR Green Ⅰ染料法,根据GenBank上其他昆虫β-actin基因的保守序列设计引物,对PCR退火温度、引物浓度、模板浓度等各反应因子进行优化,结合扩增曲线和熔解曲线进行分析。结果显示,在20μL体系下,当2×SYBRR Premix Ex TaqTM为10μL时,引物和cDNA模板的最佳浓度分别为1μmol/L和50ng/μL。最佳PCR反应程序为:94℃预变性30s,44个循环包括94℃变性10s,45℃退火30s,72℃延伸40s,最后加做熔解曲线82℃1s。结果表明,在洋虫不同发育时期β-actin基因表达水平基本稳定,因此β-actin基因可以作为洋虫实时荧光定量RT-PCR的内参基因。本研究成功建立了2-ΔΔCT相对定量法的洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系,并分析了优化PCR反应体系的重要性,建立的洋虫β-actin基因荧光定量RT-PCR方法简便、特异性强,该体系的建立可用于洋虫蜕皮相关基因表达差异的深入研究。