摘要：目的　体外研究针对大鼠凋亡基因Caspase 3设计的核酶 (Rz10 7)的体外转录 ,切割及活性鉴定及其在大鼠肝细胞系BRL 3A细胞中的切割活性。方法　将大鼠Caspase 3基因的PCR片段克隆于T载体T7启动子下游 ,32 P标记的体外转录物作为靶RNA。设计并合成针对于大鼠Caspase 3的核酶 (Rz10 7) ,将Rz10 7基因克隆于自我切割核酶载体p1 5的 5’ cis 核酶和 3’ cis 核酶之间 ,同样进行32 P标记转录。核酶与靶RNA按一定比例和条件保温切割 ,电泳后放射自显影。将携带有Rz10 7基因的真核表达质粒pcDNA3 1 Rz10 7电穿孔至BRL 3A细胞中 ,通过RT PCR方法分析Rz10 7的细胞内剪切活性。结果　Rz10 7在 37℃有活性。在一定温度范围内 ,其切割效率随温度升高而升高 ,最适温度为 50℃。其Km 为14 13nmol/L ,kcat为 2 31min 1。在BRL 3A细胞中 ,Rz10 7同样具有切割活性 ,其切割效率为 37%。结论　针对caspase 3mRNA设计的核酶 -Rz10 7,体外制备具有良好的特异催化切割活性 ,在体外及BRL 3A细胞内均能有效剪切底物RNA。这不仅对研究凋亡的发生及其机制提供了有利的研究工具 ,而且可通过抑制凋亡而成为治疗一些肝脏疾病的新方法。

摘要：目的 :稳定且具有活性的截断型人酸性成纤维细胞生长因子 (shaFGF)的构建、表达及纯化。方法 :以含全长人酸性成纤维细胞生长因子cDNA的质粒pUC haFGF为模板 ,设计一对引物 ,PCR扩增获得shaFGFcDNA ,将其克隆到表达载体pET3c中 ,重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,0 5mmol/LIPTG诱导表达 ,通过离子交换和肝素亲和层析纯化目标蛋白 ,MTT法检测促分裂活性。结果 :shaFGF的表达量约为 2 5 % ,纯化的shaFGF的促分裂活性与haFGF标准品相当。结论 :BL2 1(DE3) /pET3c表达系统能高效表达shaFGF ,纯化得到的shaFGF可供下一步的药学研究。

摘要：人表皮生长因子(hEGF)是由53氨基酸组成的小分子多肽,它通过与膜受体的相互作用调节多种类型的细胞增殖。为获得具有生物活性的基因工程产品hEGF,设计在hEGF基因5’-端插入功能序列与基因融合,经合成基因、双酶切连接,构建了重组原核表达载体pBV-F-hEGF,并导入大肠杆菌HB101菌株。工程菌在37℃LB培养基中培养至对数生长期,并在42℃温度条件下诱导表达蛋白F-hEGF。以5000 r/min离心收集细胞,利用超声波破碎细胞,以10000 r/min离心20 min收集包涵体沉淀。含有F-hEGF的包涵体溶解后,采用Ni-NTA柱纯化目的蛋白,并用SDS-PAGE鉴定目的蛋白。利用免疫组化反应和MTT方法分析F-hEGF与其膜受体EGFR的特异性结合活性和细胞增殖活性。结果显示,融合蛋白F-hEGF得到高效表达,表达量在35%左右,纯化的蛋白浓度为3.1 mg/mL,F-hEGF与膜受体能发生特异性结合,具有明显的促细胞增殖活性。本研究构建了表达生物活性F-hEGF的工程菌,为hEGF进一步的临床和开发应用提供依据。

摘要：大量研究表明转化生长因子β1参与细胞的多种生理和病理过程.为了研究TGFβ1在这些过程中的详细发病机制,设计了针对TGFβ1的非嵌合型锤头状核酶和U1小核RNA嵌合型核酶.鉴定非嵌合型锤头状核酶和U1小核RNA嵌合型核酶的胞外以及活化型肝星状细胞内的活性.核酶的胞外切割反应结果证实,非嵌合型核酶的胞外活性优于U1小核RNA嵌合型核酶.进一步研究发现,U1小核RNA嵌合型核酶在转染的肝星状细胞内可以高效下调TGFβ1的表达,且其胞内活性明显强于非嵌合型核酶.这些结果表明,抗TGFβ1的U1小核RNA嵌合型核酶不仅为TGFβ1在细胞的生理和病理过程中具体作用机制的研究提供一种有效的工具,而且有望为TGFβ1相关性疾病的治疗提供一个有效手段.

摘要：EPO是调控骨髓红系造血的关键因子，其与红系祖细胞表面的特异受体EPO—R结合引发胞内信号机制，防止细胞凋亡并促进其增殖和分化。EPO—R胞外域是与EPO发生结合的受体区段，又称为EPO结合蛋白（EBP）。迄今，采用基因工程方法制备的EBP主要被应用于受体一配体结合特性及物理结构研究，其在治疗EPO反应性增生失调如红白血病和红细胞增多症中的可能性探讨尚未见报道。我们依据EPO-R与EPO结合的化学计量特性设计了串联融合的双体结合蛋白，采用原核系统进行表达，对其体内外结合活性进行了鉴定。

摘要：目的:在原核表达载体系统中对HIV-1gp41/gp120和HIV-2gp125/gp36外膜蛋白多个抗原位点同源序列合成基因进行表达、纯化并鉴定其活性。方法:人工合成含HIV-1gp41的3个抗原位点、HIV-1gp120的2个抗原位点、HIV-2gp125的3个抗原位点和HIV-2gp36的1个抗原位点的串联基因,克隆到原核表达载体pRSETB中,构建重组表达质粒pRSETB-env,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达,采用金属离子亲和层析技术纯化表达蛋白,逐渐降低尿素浓度使目的蛋白复性,免疫印迹和ELISA法分别对表达产物进行鉴定。结果:目的基因在BL21中有较高表达率,纯化后表达蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)可见相对分子质量约44000的蛋白带,与设计相对分子质量相符。免疫印迹、ELISA试验显示pRSETB-env质粒的HIV-1/2表达蛋白与HIV-1及HIV-2患者血清都能较好地结合,与其他患者血清无交叉反应。结论:成功构建了由HIV-1/2外膜蛋白多个抗原位点串联基因片段的表达载体pRSETB-env,并在原核细胞中高效表达,表达蛋白经纯化后纯度较高,并具有良好特异性和活性。

摘要：目的:克隆小鼠白细胞介素17A(mIL-17A)基因,构建mIL-17A原核表达质粒在*** Rosetta(DE3)PlysS表达,得到有活性的mIL-17A蛋白。方法:提取人IL-1β免疫的小鼠胸腺总RNA,反转录成cDNA,以此为模板,根据GenBank报道的mIL-17A序列设计引物,进行巢式PCR,得到成熟mIL-17A的编码序列并构建到pMD18-T载体中,再亚克隆至原核表达载体pHisSUMO Express中,经DNA测序鉴定后转化Rosetta感受态细胞,IPTG诱导表达,Western blot鉴定。纯化后的蛋白处理3T3-L1前体脂肪细胞,real time PCR鉴定白细胞介素6(IL-6)的表达变化。结果:DNA测序证明所克隆基因序列与GenBank报道的完全一致。成功构建了pHisSUMO Express-mIL-17A原核表达质粒以包涵体形式表达了重组mIL-17A蛋白,且Western blot证实为目的蛋白。所得蛋白上调3T3-L1细胞表达IL-6。结论:获得具有生物活性的mIL-17A蛋白,为进一步研究其蛋白特性及其生物活性奠定基础。

摘要：目的探讨结核分枝杆菌5种Rpf样蛋白(RpfA、RpfB、RpfC、RpfD、RpfE)的生物学活性及其促生长作用。方法根据GenBank中结核分枝杆菌H37Rv基因组核酸序列分别设计5种Rpf样蛋白特异性引物序列,采用PCR技术扩增目的片段,克隆、表达及纯化结核分枝杆菌的5种Rpf样蛋白,应用获得的Rpf样蛋白对藤黄微球菌、BCG和结核分枝杆菌标准菌株H37Rv的促生长活性观察。结果成功获得了纯化的五种Rpf重组蛋白,其浓度分别为374.76μg/mL、300μg/mL、116.27μg/mL、306.9μg/mL、349.8μg/mL;促生长效果观察,其中RpfC无明显的促生长活性,RpfE的促生长活性最明显;A、B和D均有一定程度的促进这三种菌生长增殖的作用。结论Rpf样蛋白具有促进结核分枝杆菌增殖的作用,有可能成为一种新型的培养基添加剂,为结核菌的快速培养及相关研究奠定基础。

摘要：为获得高效表达的抗菌肽LL-37,根据人源抗菌肽LL-37的氨基酸序列,选择毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子的偏嗜性,通过SOEing法改造合成LL-37基因片段,克隆到pGAPZαA质粒中,获得分泌型重组酵母表达载体pGAPZαA-LL-37。pGAPZαA-LL-37通过限制性内切酶AvrII酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞SMD1168。经Zeocin抗性筛选,得到高拷贝转化子,PCR检测表明LL-37基因与毕赤酵母染色体稳定结合。在GAP启动子调控下,LL-37蛋白获得分泌表达,其上清表达量约为237mg/L。表达产物耐热性强,在100℃条件下30min内仍保持一定的抗菌活性。表达产物对大肠杆菌DH5α、大肠杆菌D31和猪链球菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为1.56μg/mL、3.12μg/mL和6.25μg/mL。

摘要：为评价抗caspase 3核酶在阻抑细胞凋亡发生中的潜在价值 ,以RNaseP催化亚基M1RNA为模板 ,设计合成 3个特异性针对人caspase 3的核酶pM1 GS716、pM1 GS337和pM1 GS2 35 ,并对它们的体内外切割活性进行探讨 .3 2 P标记的caspase 3基因片段体外转录物作为靶RNA ,体外切割实验表明 ,pM1 GS716和pM1 GS337均有切割活性 ,其中pM1 GS716的切割效率可达到 93% .3个核酶转染HeLa细胞 ,评价其在体内的切割活性 .在TNF α作用下 ,转染pM1 GS716的HeLa细胞内caspase 3mRNA下降了 75 % ,蛋白含量下降了 6 9% ,caspase 3蛋白酶活性下降了 5 2 % .Hoechst 332 5 8染色表明 ,细胞凋亡率较对照明显下降 (分别为 2 1 6± 0 7%和 4 9 4± 0 2 % ,P <0 0 1) .提示体外制备的pM1 GS716具有良好的特异催化切割活性 ,有望通过切割caspase 3而抑制细胞凋亡 .