摘要：根据JEV病毒减毒株SA14-14-2基因组序列,设计覆盖全长的4对重叠引物,以提取的活疫苗病毒RNA为模板,RT-PCR扩增出4个片段,并克隆到质粒载体中,进一步构建两个半端分子克隆,然后将全长cDNA序列克隆到一个新改造的低拷贝质粒载体pBR-kpn中,构建我国流行性乙型脑炎病毒(JEV)基因组全长cDNA克隆。经过体外转录后得到的转录子转染BHK-21细胞,重新获得JEV的恢复病毒,通过生物学特性、分子生物学水平、蛋白水平等几个方面对恢复病毒进行鉴定。结果获得了稳定的全长cDNA克隆,转录子转染BHK-21细胞后,第4天开始出现细胞病变(CPE),第6～7天时CPE为 ,经过Vero细胞进一步放大培养后,间接免疫荧光实验和RT-PCR实验均为阳性。证实了构建的JEV的全长cDNA克隆有感染性,为进一步的研究奠定了基础。

摘要：为建立一种简便、快速、灵敏、特异的乙型脑炎病毒(JEV)检测方法,本研究根据GenBank中登录的25株流行性JEV基因组序列,设计3对特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,优化反应体系,建立了一步法反转录-LAMP(RT-LAMP)检测方法。该方法检测时间短,灵敏度比常规RT-PCR方法高,可检测出103TCID50/0.2mL JEV;特异性强,对猪细小病毒、猪圆环病毒、伪狂犬病毒、猪瘟病毒等常见猪病毒均无交叉反应。结果判定时只需要在扩增产物中加入SYBR GreenⅠ染料,就可以直接在可见光或紫外光下观察颜色变化。该方法简便快捷,省时省力,是一种适用于基层实验室快速、准确检测流行性JEV的方法。

摘要：目的　获得JEVE蛋白基因并使其在E coli中高效表达 ,以研究其抗原活性 ,为进一步研制ELISA早期诊断试剂盒奠定基础。方法　根据已发表的JEVSA - 14 - 14 - 2减毒株序列 ,设计一对特异性引物 ,通过RT -PCR扩增出E蛋白基因的cDNA片段 ,并将其克隆入 pET - 32a(+)表达载体中 ,构建重组融合表达载体pET -E ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)后 ,利用IPTG诱导获得高效表达。结果　扩增的E蛋白基因片段长 1113bp ,编码 371个氨基酸残基 ,该基因片段与国内发表的减毒株SA14 - 14 - 2碱基序列同源性为 10 0 %。表达产物分子量约为 6 2kD ,经Westernblotting分析表明表达产物具有较好的抗原性。结论　通过序列分析表明 ,我国的JEVSA - 14 - 14 - 2减毒株未发生基因突变。表达产物的稳定高效表达及其抗原特异性分析为今后ELISA早期诊断试剂盒的研制提供了依据。

摘要：目的建立一种特异、灵敏、快速检测流行性乙型脑炎（乙脑）病毒的荧光定量RT-PCR方法。方法根据GenBank登录的乙脑病毒毒株序列，应用生物软件在乙脑病毒基因的保守区设计与筛选引物和探针，对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化，验证方法的特异性、敏感性和重复性。并通过对蚊虫样本的检测，以评价该方法的实际应用价值。结果优化结果表明荧光定量RT-PCR的最佳反应体系为0．1gmol／L探针浓度，0．2gmol／L引物浓度，5mmol／L Mg^2＋浓度。结果表明该方法对乙脑病毒的检测有高度的特异性、通用性，对1～4型登革热病毒、狂犬病毒、汉坦病毒（SEO型与HTN型）均无交叉反应，检测的灵敏度达0．1TCID50，重复性分析表明同一样品Ct值的重复检测4次，其标准差均在合理范围内，分别为0．033、0．079、0．149和0．411。对110批蚊虫标本进行荧光定量RT-PCR检测和病毒分离检测，结果荧光定量RT-PCR检测出7份阳性，而病毒分离则只检测出3份阳性，表明建立的荧光定量RT-PCR方法更敏感，可直接从蚊虫样本中检测乙脑病毒核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右，且操作简便、敏感性高。结论研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR的方法具有特异、敏感、快速的特点，适用于乙脑病原学的快速检测。

摘要：目的分析中国首次分离的基因Ⅰ型流行性乙型脑炎病毒(JEV)全基因组的基因组特征。方法设计JEV全基因组扩增引物,RT-PCR扩增片断,PCR产物直接测序,拼接后获得全基因组序列。采用生物学软件进行同源性和系统进化分析。结果 1977和1982年分离自云南蚊虫的M28和BN82215病毒株基因组全长分别为10 969bp和10 970bp,5′非编码区均含有96个核苷酸,3′非编码区含有573和574个核苷酸。它们的开放阅读框(ORF)都从97到10 396位,共10 299个核苷酸,编码3 433个氨基酸。M28和BN82215株与来自GenBank的5个基因型JEV株的全基因组核苷酸和氨基酸同源性分别为78.4%~96.3%和91.4%~99.6%,与近几年国内外基因Ⅰ型流行株的同源性最高,进化关系最接近,都属于基因Ⅰ型。这两株病毒与JEV疫苗株SA14-14-2相比,有56个氨基酸差异,其中E基因有11个氨基酸差异,但都不属抗原关键位点。结论本研究阐明了中国首次分离的基因Ⅰ型JEV的全基因组分子特征,决定病毒抗原和毒力的E蛋白关键位点无明显变化。证实20世纪70和80年代云南省就有基因Ⅰ型JEV流行。

摘要：目的;获得JEVE蛋白基因,构建重组表达载体并在***中高效表达。方法:参照GeneBank中的日本乙型脑炎病毒SA14-14株序列设计一对特异性引物,采用RT-PCR法扩增E基因全长,克隆至PUCm-T载体,经测序证实后克隆至原核表达载体pET32a中,转化入BL21(DE3),IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析。结果:限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了JEVE蛋白基因全长1500bp,成功构建了重组质粒pET-32a/JEVE,SDS-PAGE分析显示目的蛋白主要以包涵体的形式在大肠杆菌中获得表达,表达量占总菌体蛋白的35%。结论:在大肠杆菌中成功表达了JEVE蛋白,为ELISA早期诊断试剂盒的研制和E蛋白基因结构与功能的分析奠定了基础。

摘要：为建立猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)的定量检测方法,本实验根据JEV的E基因保守序列设计一对特异性引物及探针,并以E基因重组质粒作为标准品,建立检测JEV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,该方法的灵敏度可达到10个拷贝,是常规PCR灵敏度的100倍。该方法对其它相关猪病病毒的检测显示均为阴性。重复性试验表明该方法的组间和组内的变异系数均小于2%。通过检测未免疫猪和免疫减毒活疫苗猪在感染JEV后的病毒血症样品,将该方法与JEV传统病毒分离方法进行比较,结果表明该方法与乳鼠脑内接种方法灵敏度相同,比细胞分离方法灵敏度高。该方法可以作为临床检测JEV及评价疫苗保护效力的检测方法。

摘要：目的建立流行性乙型脑炎病毒(JEV)和西尼罗病毒(WNV)的双重微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法。方法基于已设计的JEV和WNV引物探针,建立JEV和WNV双重ddPCR检测反应体系,摸索检测的敏感性、特异性和可重复性,灵敏度与双重荧光定量PCR(qPCR)的每个反应管内荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数(Ct)值做对比。结果双重ddPCR检测反应体系对JEV和WNV的检测灵敏度均可达到102拷贝/µl,该方法的可重复性、特异性良好,未发现与登革病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、蜱传脑炎病毒以及人类基因组有交叉反应。结论建立的双重ddPCR方法能敏感、特异检测JEV和WNV,为不同场景下这2种病毒的检测提供了解决方案。

摘要：目的对云南省新分离的2株流行性乙型脑炎(乙脑)病毒进行全基因组序列测定和分析,了解当地乙脑病毒基因组结构及分型特征。方法设计乙脑病毒全基因组扩增引物,RT-PCR扩增片段,PCR产物直接测序,拼接后获得全基因组序列。通过Clustal X(1.8)、DNASTAR、GENEDOC(3.2)等生物学软件进行核苷酸序列及氨基酸序列分析和病毒的系统进化分析。结果从2007年云南省捕获的三带喙库蚊中分离到2株乙脑病毒(TC07018、TC07172),并对病毒株的全基因组序列进行了分子生物学研究,结果提示TC07018、TC07172株与JEVMie40株的核苷酸同源性最高,为98.4%和98.7%,与JKT6468株核苷酸同源性最低,为83.6%和83.5%。2个分离株与JEVMie40、SH17M-07和HEN0701株氨基酸同源性最高,均为99.6%,与JKT6468株氨基酸同源性最低,为95.5%和95.4%。2个新分离株与我国现在最常用的疫苗株SA14-14-2相比较,核苷酸同源性为88.7%和88.6%,氨基酸同源性为97.1%。基于全基因序列,从基因库中选择了36株乙脑病毒与分离株进行进化分析,2个新分离株与KV1899和HEN0701的进化关系最接近,都属于基因Ⅰ型。结论新分离的2株乙脑病毒属于基因Ⅰ型,此为滇西地区首次分离该型病毒。这2株病毒与国内外基因Ⅰ型乙脑病毒流行株间存在一定差异,但根据抗原和毒力位点分析表明,乙脑SA14-14-2疫苗株能保护该型病毒。

摘要：目的原核表达、纯化蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)非结构蛋白1(non-structural protein 1,NS1),并评价其在蜱传脑炎(tick-borne encephalitis,TBE)临床诊断中的应用价值。方法根据GenBank登录的TBEV“森张”株NS1基因序列设计引物,PCR扩增TBEV NS1基因,克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-NS1,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经GST bestarose 4FF亲和层析纯化后,Western blot检测其反应原性;以重组NS1蛋白为固相抗原,采用间接ELISA法检测临床血清。结果重组表达质粒pGEX-4T-1-NS1经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约65000,表达量为22.1%,主要以包涵体形式存在;纯化蛋白纯度达93%以上,与TBEV全病毒感染小鼠血清具有良好的反应原性。采用NS1作为包被抗原的间接ELISA法检测临床血清,特异性为95%,敏感度为100%。结论成功在大肠埃希菌中表达并纯化了TBEV NS1蛋白;作为病毒特异性抗原,经间接ELISA法验证,该蛋白在临床疾病的血清学诊断上具有一定的应用价值。