摘要：禽流感病毒 H_5和 H_9,亚型 RT-PCR 检测方法的建立/刘燕(吉林农业大学动物科技学院 130118),钱爱东//吉林农业大学学报.-2004,26(1).-93～96根据 H_5和 H_9亚型的 HA 基因,设计合成2对特异性引物,分别建立了 RT-PCR 检测方法,优化了反应体系及反应条件。该方法敏感性可达10^(-3),特异性好,与 NFV、IBV 和 H_5与 H_9相互间无交叉反应。利用所建立的 RT-PCR 检测了10份活禽及禽产品中存在的 H_5和 H_9亚型禽流感病毒,其检测结果与病毒的分离培养一致,比电镜和琼扩的检出率高30%,与其他 NDV、IBV 的病料无交叉反应。证明该方法具有很好的应用价值。

摘要：目的建立一种可以准确、快速、特异检测乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)的一步法实时荧光定量逆转录PCR(reverse transcription-quantitative real time PCR,RT-q PCR)体系。方法参照NCBI数据库的乙脑病毒全基因组序列,经过一致性比对分析,在乙脑病毒保守的3′非翻译区(3′untranslated region,3′UTR)区段,设计相应的特异性引物以及Taqman-MGB探针,优化检测体系及反应条件,建立一步法RT-q PCR方法。利用登革热、森林脑炎病毒、肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A16型(Cox A16)、狂犬病毒培养物和临床诊断为登革热及手足口病人的血清样本检测其交叉反应。选择15例疑似脑炎症状的病人血清样本,以国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准的乙脑病毒检测试剂盒作对照试剂盒,检测其临床适用性。结果所建立的乙脑病毒一步法RT-q PCR检测方法重复性试验Ct值的变异系数CV在0.46%~0.53%之间,最低可检出5 copies/反应样本。检测体系与登革热、森林脑炎病毒等黄病毒及EV71、Cox A16、狂犬病毒培养物等未发现交叉反应;64份临床诊断为登革热和手足口病人的血清样本检测也均为阴性。15份疑似乙脑感染的病人血清样本的检测结果与国家食品药品监督管理总局批准的乙型脑炎病毒检测试剂盒检测结果一致,但本方法操作步骤更少,检测时间更短。结论本实验建立的乙型脑炎病毒一步法实时荧光RT-q PCR检测方法具有较高灵敏度、特异性,可用于乙型脑炎病毒的检测。

摘要：流行性乙型脑炎（Japanese Encephalitis，JE）是一种人与动物共患的虫媒病毒性疾病，严重危害着人畜的健康。E蛋白是乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus，JEV）的主要结构蛋白，在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。为了确定该蛋白的抗原优势区域，本研究设计了3对引物，将E蛋白分成3个大段，分别是EF1（1～291aa）、EF2（292～402aa）和EF3（403-500aa），又将EF1分成4个相互重叠的小片段，分别是EF1-1（1～88aa）、EF1—2（68～155aa）、EF1—3（129～222aa）和EF1—4（202～291aa），将以上基因片段分别克隆到原核表达载体进行GST融合表达。SDS-PAGE电泳鉴定各融合蛋白均获得表达，各表达产物以包涵体的形式存在。通过Western blot分析表明融合蛋白GST-EF1、GST—EF2、GST—EF1—1、GST-EF1-2、GST—EF1—3和GST—EF1～4均能被阳性血清识别。通过ELISA鉴定，GST-EF2反应性最强，GST-EF1反应性比GST-EF2稍弱，而GST-EF3反应性最弱，GST-EF1-1、GST-EF1—2、GST-EF1—3和GST—EF1—4片段融合蛋白反应性与GST—EF1相似。由此本研究鉴定出1-402aa是E蛋白的抗原优势区域，在此区域内包括了12个Cys的保守区及域Ⅰ、域Ⅱ和域Ⅲ3个主要抗原域。E蛋白抗原优势区域的鉴定，为E蛋白抗原表位的鉴定以及针对于E蛋白诊断试剂的开发奠定了基础。