摘要：【目的】Ⅲ型海葵毒素(Av3)对昆虫具有显著的选择性毒性,对其作用机制的研究对新型高选择性毒性杀虫剂的设计研究具有重要意义。【方法】反向高效液相色谱及电喷雾质谱用于鉴定化学合成的Av3野生型(Av3 wild type,Av3-WT)及其突变体的纯度和分子量;生物活性测定检测Av3-WT及其突变体对德国小蠊Blattella germanica成虫的毒力;双电极电压钳技术检测Av3-WT及其突变体对德国小蠊钠通道BgNav1-1a失活的抑制作用。构建基于BgNav1-1a与大鼠钠通道rNav1.2a的重组嵌合体,通过双电极电压钳技术确定BgNav1-1a上参与Av3-WT选择性毒性的关键区域。【结果】芳香族氨基酸Y7,W8和Y18分别突变后形成的Av3-WT突变体Y7A,W8A和Y18A对德国小蠊成虫的毒力显著降低,半数击倒剂量(KD_(50))与Av3-WT相比均增加了超过10倍;与Av3-WT对通道失活62%的抑制率相比,250 nmol/L的毒素突变体Y7A,W8A和Y18A对BgNav1-1a失活的抑制作用也显著降低,通道失活的抑制率分别降低到12%,23%和8%;以rNav1.2a胞外环DI/SS5-S6替换BgNav1-1a的相应序列获得的重组嵌合体钠通道对Av3-WT毒素的敏感性几乎丧失,仅3.6%的通道在1μmol/L Av3-WT作用下失活被抑制。BgNav1-1a胞外环DI/SS2-S6上的His404突变为Tyr后几乎丧失对毒素的敏感性,仅6%的通道在1μmol/L Av3-WT作用下失活被抑制。【结论】芳香族氨基酸Tyr7,Trp8和Tyr18参与到构成Av3-WT分子的生物活性表面;钠离子通道胞外环DI/SS2-S6是影响Av3-WT毒素发挥选择性的关键结合区域,BgNav1-1a的DI/SS2-S6上的His404则是影响Av3-WT选择性毒性的关键氨基酸。

摘要：按照毕氏酵母的偏爱密码子,设计并合成了海葵毒素AP-b的基因序列,将合成基因序列通过一系列操作导入毕氏酵母表达载体pPICZα中,以电穿孔方法转化毕氏酵母菌株X33,通过PCR法鉴定,筛选出能够表达重组海葵毒素的酵母菌株.结果表明,构建出海葵毒素AP-B毕赤酵母真核表达体系,并鉴定出4株含有海葵毒素基因的毕赤酵母工程菌.

摘要：青岛海葵中存在两种具有增强心肌收缩功能的多肽类毒素 (分别命名为Ap QD1和Ap QD2 ) .通过分析已经得到Ap QD2的氨基酸序列 ,按照毕氏酵母的偏爱密码子设计并合成了Ap QD2的cDNA .将合成cDNA序列通过PCR扩增及一系列分子克隆操作导入毕氏酵母表达载体 pPICZαA中 ,以电穿孔方法转化毕氏酵母GS115和KM71,并进行转化子的表型及高拷贝化筛选 .其中的KM 71(Muts)的转化子经摇瓶发酵 ,每升发酵液可表达约 2 0mg的重组Ap QD2产物 ,通过纯化可得到 7mg纯的有天然生物学活性的Ap QD2基因工程产物 .