摘要：Microcosmic (miRNAs)是一类具有调控功能的内源性单链非编码小分子RNA,通过在转录后水平与靶基因互补结合来调控靶基因的表达。海藻糖是一种广泛存在于植物体内的渗透调节性物质,其在植物响应干旱胁迫中发挥着非常重要的作用。本研究利用人工miRNA技术(artificial microRNA, amiRNA)设计特异性沉默马铃薯海藻糖基因(StTRE)的人工miRNA (amiR-StTRE),并利用巢式PCR技术克隆得到包含amiRTRE前体序列的701 bp目的片段。然后将获得的DNA片段(701 bp)与表达载体pCPB121通过双酶切和质粒重组法构建StTRE基因amiRNA表达载体(pCPB121-amiR-StTRE),并经过双酶切图谱分析和测序检测,成功构建了表达载体pCPB121-amiR-StTRE。以期有目的地利用amiRNA进行马铃薯的抗旱性遗传改良提供分子理论依据。

摘要：为了明确豌豆蚜可溶型海藻糖酶基因在基于RNA干扰技术的害虫防治中的应用潜力,该研究根据豌豆蚜基因组数据克隆获得了可溶型海藻糖酶基因(ApTre-1),通过在线软件对其氨基酸序列进行了分析,并利用实时荧光定量PCR技术分析了ApTre-1基因在豌豆蚜不同龄期的表达水平变化;设计合成了2种dsRNA片段(dsApTre-1-1和dsApTre-1-2),采用显微注射法测定了其对靶基因ApTre-1的RNA干扰效率;选取干扰效率较高的dsRNA片段与人工饲料混合后,进一步采用饲喂法测定其对豌豆蚜生长的影响和致死效应.研究结果表明:豌豆蚜ApTre-1基因的开放阅读框全长为1770 bp,编码589个氨基酸,在DNA水平上由9个外显子和8个内含子组成;ApTre-1蛋白的N端含有一段长为20 aa的信号肽序列,具有典型的昆虫海藻糖酶标签序列.荧光定量PCR检测结果表明:ApTre-1基因在豌豆蚜1龄若虫阶段的相对表达量最高.显微注射法测定结果表明:dsApTre-1-1对靶基因ApTre-1具有相对较高的干扰效率.进一步采用饲喂法测定结果表明:豌豆蚜取食dsApTre-1-1后,靶基因表达水平显著下降,豌豆蚜的生长也受到较为明显的抑制,但死亡率较低(17.5%).

摘要：干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。本研究以稻纵卷叶螟可溶型海藻糖酶基因(Cm Tre1)为靶标,设计RNAi靶位点并将其命名为Cm Tre1*,在其两端分别添加Bam H I与Spe I酶切位点并进行人工合成,然后经双酶切后与p1301植物表达载体连接,构建重组表达载体p1301-Cm Tre1*。PCR、双酶切和测序鉴定结果证明重组表达载体p1301-Cm Tre1*构建成功,并将其成功转入农杆菌LBA4404,构建基因工程菌。用含有p1301-Cm Tre1*质粒的农杆菌LBA4404浸染中花11号水稻的愈伤组织,经过愈伤组织的抗性筛选、分化和植株再生,获得26株阳性转基因植株。用取食非转基因水稻的稻纵卷叶螟作为对照,用实时荧光定量PCR方法分株测定取食转基因水稻稻纵卷叶螟体内Cm Tre1基因的mRNA表达水平,并检测其体内海藻糖酶活性变化。结果显示,相较于对照组,取食转基因水稻稻纵卷叶螟体内Cm Tre1基因表达量下降了44.79%,海藻糖酶活力平均下降了14.94%。研究结果表明转基因水稻的RNA干扰效应相当明显,能对取食其叶片的稻纵卷叶螟Cm Tre1基因起到明显的沉默作用。