摘要：目的 观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子C(VEGF-C)在骨髓间充质干细胞(BMSC)向淋巴管内皮细胞(LEC)分化中的作用. 方法 取第3~5代大鼠BMSC进行实验.(1)取大鼠BMSC,采用随机数字表法(分组方法下同)分为阴性对照组、CD90组、CD44组、CD34组,每组样本数为3,阴性对照组细胞加入磷酸盐缓冲液5μL,余3组细胞分别加入相应抗体5 μL,流式细胞仪检测细胞表面抗原阳性情况.(2)取3个批次大鼠BMSC,均分为空白对照组、VEGF-C组、HGF组、bFGF组、VEGF-C+HGF组、VEGF-C+bFGF组、HGF+bFGF组、VEGF-C+ HGF+ bFGF组,每组样本数为3.空白对照组细胞加入2 mL完全培养基,VEGF-C组细胞中加入2 mL完全培养基和10 μg/mL VEGF-C 10 μL,HGF组细胞加入2 mL完全培养基和10 μg/mL HGF 16 μL,bFGF组细胞加入2 mL完全培养基和1μg/mL bFGF 20 μL,VEGF-C+ HGF组、VEGF-C +bFGF组、HGF+ bFGF组、VEGF-C+ HGF+ bFGF组细胞加入2 mL完全培养基及同前相应浓度和量的诱导因子.培养10d,倒置相差显微镜下观察细胞形态,蛋白质印迹法和实时荧光定量反转录PCR法分别检测淋巴管内皮透明质酸受体1(LYVE-1)、VEGF受体3(VEGFR3)及整合素α9蛋白和mRNA表达.(3)取大鼠BMSC,分为空白对照组、HGF+ VEGF-C+ bFGF组、bFGF+ VEGF-C+HGF组、VEGF-C+ HGF+ bFGF组,每组样本数为3.空白对照组细胞加入2 mL完全培养基;HGF+VEGF-C +bFGF组细胞加入2 mL完全培养基、10 μg/mL HGF 16 μL、10 μg/mL VEGF-C 10μL,6h后加入1 μg/mL bFGF 20 μ***+VEGF-C+HGF组细胞加入2 mL完全培养基以及1μg/mLbFGF 20 μL和10 μg/mL VEGF-C 10 μL,6h后加入10 μg/mL HGF 16 μL;VEGF-C+ HGF+ bFGF组细胞同时加入2 mL完全培养基及同前浓度及量的3种诱导因子.另取2个批次大鼠BMSC,同前进行分组,除将HGF+ VEGF-C+ bFGF组、bFGF+ VEGF-C+ HGF组6h的间隔时间调整为12、24 h外,其余处理方法同前.培养10 d,蛋白质印迹法检测LYVE-1、VEGFR3及整合素α9的蛋白表达.对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD-t检验、Bonferroni校正. 结果 (1)阴性对照组、CD90组、CD44组、CD34组细胞表面抗原阳性表达率分别为0.39%、99.84%、99.90%、0.57%.(2)培养10 d,空白对照组、HGF组、bFGF组、HGF+ bFGF组细胞呈长梭形,其余各组细胞呈多边形.(3)培养10d,空白对照组、HGF组、bFGF组、HGF+ bFGF组细胞无LYVE-1、VEGFR3和整合素α9蛋白表达.培养10 d,VEGF-C+ HGF+ bFGF组细胞LYVE-1、VEGFR3和整合素α9的蛋白表达量均明显高于VEGF-C组(t=24.21、11.04、15.43,P<0.01)、VEGF-C+ HGF组(t=10.81、9.93、10.20,P <0.01)、VEGF-C+ bFGF组(t=11.67、6.32、19.00,P<0.01). VEGF-C +HGF组及VEGF-C+bFGF组细胞LYVE-1的蛋白表达量明显高于VEGF-C组(t=8.69、15.20,P<0.01);VEGF-C+bFGF组细胞VEGFR3的蛋白表达量明显高于VEGF-C组及VEGF-C+HGF组(t=8.67、7.21,P<0.01);VEGF-C+ HGF组细胞整合素α9的蛋白表达量明显高于VEGF-C组及VEGF-C+ bFGF组(t=8.80、8.83,P<0.01).(4)培养10d,空白对照组、HGF组、bFGF组、HGF+ bFGF组细胞均无LYVE-1、VEGFR3和整合素α9 mRNA表达.培养10d,VEGF-C组细胞LYVE-1、VEGFR3的mRNA表达量明显低于VEGF-C+ bFGF组、VEGF-C+ HGF+ bFGF组(tLYVE-1=6.22、18.01,tVEGFR3=8.49、15.34,P<0.01),整合素α9的mRNA表达量明显低于VEGF-C+ HGF组、VEGF-C+ HGF+ bFGF组(t=13.24、9.65,P<0.01).VEGF-C+HGF+

摘要：为了研制出能同时阻断肿瘤血管与淋巴管生成的抗肿瘤制剂,我们设计构建了同时包含VEGFR1和VEGFR3功能域的基因工程双功能融合受体(VEGFRIg)。为了改善VEGFRIg的血浆半衰期以增强其抗肿瘤疗效,我们选择VEGFRIg的3个碱性氨基酸进行突变诱导获得了双功能受体的突变体VEGFRIgm。研究结果表明,VEGFRIgm具有与VEGFRIg相似的与VEGF-A和VEGF-C结合的能力,能有效地抑制VEGF-A诱导的人脐静脉内皮细胞增殖及VEGF-C诱导的人皮肤淋巴内皮细胞增殖。进一步研究表明,VEGFRIgm在小鼠体内的半衰期比VEGFRIg显著延长,提示其可能发展成为一个新型的高效抗肿瘤药物。

摘要：目的研究硫酸酯酶2(Heparan sulfate 2,Sulf2)在淋巴管生成中的作用。方法根据Sulf2 cDNA序列,设计并构建pCDH-Flag-Sulf2真核表达载体,慢病毒转染293FT细胞,获得合成纯化的rSulf2。通过流式分析、成管试验、裸鼠耳部淋巴管生成模型等实验,研究rSulf2对于淋巴管内皮细胞(Lymphatic endothelial cells,LECs)细胞周期、凋亡、成管能力和淋巴管生成的影响。结果构建的pCDH-Flag-Sulf2真核表达载体,经酶切和测序证明构建完全正确。Western blot检测证明293FT细胞转染pCDH-Flag-Sulf2真核表达载体后,rSulf2表达增高。合成纯化的rSulf2可以减少无血清培养液诱导的LECs细胞的凋亡,增加活细胞的比例,但对细胞周期无显著影响,rSulf2还可以增加淋巴管内皮细胞的体外成管能力及增加裸鼠耳部淋巴管的数量。结论 Sulf2可以抑制LECs细胞的凋亡,对淋巴管生成起到促进作用。