摘要：DNA水凝胶是DNA分子链在水溶液中交联形成的三维网状结构,是生物技术及新材料领域的研究新热点。由于DNA分子卓越的特异性与可设计性,利用DNA分子形成具有拓扑结构的DNA水凝胶在实现水凝胶可设计性的同时也能具有智能响应性,在药物运输、生物传感等领域展现出广泛的用途,但该凝胶的制备仍然面临成本高昂及成胶效率低下等问题。滚环扩增技术作为一种新型的酶介导等温扩增方式,极大地节省了合成成本,同时也为单链DNA的有效扩增提供了新的方法,将凝胶的制备变得方便快捷,并且在此基础上赋予其独特的性质。本综述主要介绍了近年来基于滚环扩增制备的新型DNA水凝胶,并对其设计理念、形成机理、优势与难点进行讨论。

摘要：滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)是一种以环状DNA单链为模板,由DNA聚合酶介导的高效等温酶促反应,具有简便、快速、高效等优点,能在短时间内快速产生大量具有重复碱基序列的超长单链DNA。由于DNA的可编码性,可以根据需要去设计模板DNA序列,从而产生大量功能性的产物,在生物检测、药物递送等领域发挥出独特优势。本文概述了RCA技术的基本原理与分类,并着重介绍了近几年RCA技术在肿瘤检测及药物递送方面的应用,最后讨论了该技术的应用前景和所面临的挑战。

摘要：为建立快速准确的副溶血性弧菌的检测体系，根据滚环扩增方法的原理设计引物、锁式探针以及反应体系。锁式探针两端与目标序列特异性结合，并用DNA连接酶使其形成环状，然后利用引物滚环扩增环形核酸，最后用凝胶电泳方法验证扩增产物。试验结果显示，该方法可以成功检测副溶血性弧菌，并不会扩增其他菌，灵敏度要比普通PCR方法高。研究结果显示，RCA检测体系具有很好的特异性、灵敏度和稳定性，适用于副溶血性弧菌的检测和鉴定。

摘要：滚环扩增(RCA)是新近发展起来的一种能特异性扩增环形DNA的实验技术,自2008年以来被广泛用于HBV基因全长扩增及共价闭合环状DNA(cccDNA)耐药突变分析等研究。为了便于鸭乙型肝炎病毒(DHBV)cccDNA的分析,本研究建立了基于RCA的DHBV cccDNA的检测方法。通过针对DHBV高度保守序列设计的4对RCA硫化修饰引物,以血清DHBV DNA为阴性对照,从肝组织DHBV DNA标本中扩增得到DHBV cccDNA。然后用跨缺口引物扩增RCA产物测序替代限制性内切酶切分析进行DHBV cccDNA鉴定。应用该方法检测39份携带DHBV麻鸭肝组织与血清标本结果显示:全部肝组织标本均检出DHBV cccDNA,而全部血清标本则均无DHBV cccDNA检出,表明本研究建立的基于RCA的DHBV cccDNA检测法具有良好的特异性和灵敏性。该方法的建立为应用鸭乙型肝炎病毒动物模型研究cccDNA在病毒致病机制中的作用以及评价抗病毒疗效奠定了实验基础。

摘要：目的研究滚环扩增(RCA)技术结合特异性表面等离子共振(SPR)金膜芯片检测丙型肝炎病毒(HCV)的方法。方法根据丙型肝炎x-tail区域的特异检测序列,设计并合成针对RCA法检测HCV的探针和引物,分成3组(实验组、阴性样品组和阳性样品组)进行RCA实验,验证RCA法检测HCV的特异性。将模板浓度按10倍梯度稀释,评价SPR技术结合RCA法检测的检测限。在普通金膜芯片的基础上进行表面化学处理,形成高特异性核酸芯片,用抗蛋白实验验证芯片抗蛋白能力。采用双通道SPR仪对RCA反应及信号放大反应进行实时观测。运用SPR技术结合RCA法检测63例临床血液样品,并与Real-Time PCR法比较,评价其灵敏度和特异度。结果 SPR技术结合RCA法对HCV阳性标准品的最低检测浓度为1 pmol/L,低于Real-TimePCR法的检测限(0.1 nmol/L)。SPR芯片具备良好的抗蛋白质非特异性吸附能力。双通道SPR仪对RCA芯片系统的检测信噪比为100,实现了对HCV的检测。对临床样品的检测灵敏度为90.0%(27/30),特异度为84.8%(28/33)(χ2=8.10,P=0.004)。结论 SPR技术结合RCA法将生物传感技术及原位扩增技术相结合,实现了快速、非标记和实时检测HCV。

摘要：目的建立检测家兔豆状囊尾蚴感染的滚环扩增(RCA)方法。方法以家兔血清中豆状囊尾蚴来源的novel⁃miR1为诊断靶标,设计连接序列和锁式探针,并对连接序列和锁式探针的比例、反应时间、酶用量、dNTP用量以及扩增反应时间等5个重要条件进行优化,建立检测豆状囊尾蚴感染的RCA方法。将novel⁃miR1标准品倍比稀释为1 fmol/L至100 nmol/L的9个不同浓度的样品,评价RCA方法的灵敏度。用优化后的RCA方法分别检测健康家兔和豆状囊尾蚴感染家兔血清miRNA各20份(实验室保存样品),并通过受试者工作特征(ROC)曲线分析其敏感性和特异性。20只雌性家兔每只经口感染1000个豆状带绦虫虫卵,采集感染前和感染后每个月的家兔血样制备血清miRNA,用优化后的RCA方法进行检测,评价其应用效果。结果电泳结果显示,RCA扩增产物的DNA停留在加样孔中,形成一条明亮条带。反应条件优化试验结果显示,连接序列浓度为2μmol/L、锁式探针浓度为1μmol/L(连接序列和锁式探针的比为2∶1)、T4 DNA连接酶为350 U、连接180 min时连接效率最高。在100μl的扩增体系中,dNTP浓度为0.5μmol/L,扩增240 min时,RCA扩增效果最佳。优化后RCA的最低检测浓度为10 pmol/L。RCA检测健康家兔和豆状囊尾蚴感染家兔血清miRNA样品的平均荧光值分别为53.298±1.707和97.498±5.892,差异有统计学意义(t=7.206,P<0.01)。ROC分析结果显示,当阳性临界值为61.69时,RCA方法的敏感性和特异性均为95%,AUC为0.9550,似然比为19.00。RCA检测豆状囊尾蚴感染后不同时间的家兔血清miRNA结果显示,20份感染前的血清中19份检测结果为阴性,1份为阳性;感染后1个月的血清中,17份为阳性,2份为疑似,1份为阴性;感染后2个月的血清,1份为阴性,其余为阳性;感染后3个月的血清,3份为阴性,其余为阳性。结论建立了检测家兔豆状囊尾蚴感染的RCA方法,该方法在豆状囊尾蚴感染后3个月内的家兔血清中检出novel⁃miR1,具有良好的应用潜力。

摘要：目的建立慢性乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)的滚环扩增(RCA)方法。方法以27例慢性乙型肝炎患者的肝组织cccDNA和血清松弛环状DNA(rcDNA)为研究对象。根据中国患者HBV基因序列特点设计4对引物,分别可与HBVcccDNA的正、负链结合。在Phi29DNA聚合酶的作用下,获得线性多拷贝cccDNA扩增产物,以该产物为模板获得cccDNA全序列;通过对模板的系列稀释鉴定RCA方法的灵敏度;以RCA产物为模板扩增肝组织cccDNA的反转录酶区基因,并与同时扩增的同时间采集的同一患者血清中的rcDNA序列进行比较。结果成功建立了HBVcccDNA全序列的RCA方法,最低可检测到10个拷贝的cccDNA分子,并获得了所有扩增cccDNA的全基因序列。27例患者中,18例患者的肝组织cccDNA和血清rcDNA反转录酶区的序列完全一致,9例患者中共检出84个不同的核苷酸位点,平均每个患者9.3个,84个不同核苷酸中只有5个引起了氨基酸的改变。结论滚环扩增方法对肝组织HBVcccDNA的检测具有较好的灵敏度。该方法的建立对深入了解cccDNA在HBV致病机制中的作用以及评价抗病毒疗效有重要意义。

摘要：目的 建立滚环扩增技术检测5种常见的细胞污染支原体（猪鼻支原体、发酵支原体、口腔支原体、精氨酸支原体、莱氏无胆甾原体）的方法.方法 使用细胞污染支原体16S-23SrRNA间隔区公共引物（SPS1,SPA2）扩增间隔区靶基因.设计每一种支原体特异性锁式探针,锁式探针与扩增的靶基因杂交结合形成环化单链分子,加入特异性引物在Corbett RotorGeneTM 6000扩增仪滚动扩增环化单链分子,观察结果.结果 滚环扩增技术能敏感和特异的检测上述5种支原体标准株,并能敏感的检测10个拷贝的靶基因.在62个细胞培养物样本的检测中,37个样本检测出一种支原体,14个样本检测出两种支原体,11个样本为支原体阴性.滚环扩增方法检测结果与支原体种特异性PCR检测结果一致.结论 滚环扩增作为一种新的扩增技术能敏感和特异的检测细胞污染支原体.

摘要：根据柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis ***,Xac)独有的蛋白基因序列和锁式探针公共连接序列分别设计特异性的锁式探针及其扩增引物,优化系列反应条件,建立了特异性的柑桔溃疡病菌滚环扩增体系。初步检测结果表明该体系能够特异性地检出Xac的菌体细胞及其DNA,而检测不出供试的其它植物病原细菌和柑桔叶面常见的多种附生细菌;对Xac靶片段克隆质粒DNA的检测灵敏度为102copy/μL,对Xac菌悬液的检测灵敏度为20cfu/μL,比常规PCR的检测灵敏度稍高。用滚环扩增技术和常规PCR技术对田间采集的实际样品进行了检测,两种方法的检测结果没有显著差异(P>0.01)。由于锁式探针的公共连接序列对扩增的条件要求一致,本体系的建立可以为植物病原微生物多靶标检测和病害检疫检验提供新的技术支撑。

摘要：针对靶标自环化滚环扩增(TC-RCA)难以高灵敏度检测的难题,本文探究了扩增过程中靶标环化效率低的原因,并构建了新型动态接头以提高靶标DNA的环化灵敏度。通过采用含有发卡结构的动态接头(18 nt),使接头的两端产生连接活性差异,探讨发卡接头打开与闭合的动态平衡在提高环化灵敏度中的作用。具体研究了发卡动态接头的稳定性和磷酸化对连接及环化效率的影响。研究表明,增加接头两端的连接活性差异可提高环化灵敏度(106 copies/μL),从而揭示了TC-RCA灵敏度低的根本原因。由于许多过量的接头同时连接到靶标DNA两端后,靶标无法环化,造成仅有少部分靶标环化为RCA模板,导致极低浓度的靶标无法发生RCA。在此基础上,采用另一种10 nt的短链动态接头,使检测灵敏度提高了两个数量级(达104 copies/μL)。本研究为TC-RCA中接头的设计提供了新思路,对双链DNA环化机理的深入研究具有重要意义。