摘要：目的构建烟曲霉Bem46基因敲除株,初步明确Bem46基因在烟曲霉生长出芽和各种压力传导中的作用,以及对细胞壁形成的影响。方法采用生物信息学方法查找烟曲霉中Bem46基因,设计引物,并以pyrG作为筛选标记构建烟曲霉Bem46基因敲除株(ΔBem46)。观察含不同压力物质培养基上对照菌株和ΔBem46径向生长速度,观察两菌株发芽状况以及在含有细胞壁抑制剂培养基上的生长状况。结果通过序列比对在烟曲霉基因组中找到了Bem46基因,其编号为Afu7g04660,由1 116bp碱基组成,编码311个氨基酸。使用原生质体法得到烟曲霉ΔBem46并经PCR和Southernblot确认。经观察在含有山梨醇作为渗透压力来源的培养基上ΔBem46生长明显较对照菌株快。显微镜下观察到在GMM液体培养基中,ΔBem46发芽速度慢于对照株。结论烟曲霉Bem46基因涉及由山梨醇引起的渗透压压力传导,并且该基因对促进孢子发芽可能有作用。

摘要：目的:以烟曲霉CEA-1701为生产菌株,对烟曲霉素发酵培养基进行优化。方法:运用HPLC测定发酵液中烟曲霉素含量,通过单因素实验选择发酵碳源和氮源种类,进一步用Plackett-Burman(PB)和Box-Behnken Design(BBD)设计优化各成分在培养基中的浓度。结果:单因素实验筛选到适宜烟曲霉素合成的碳源和氮源分别为甘油和酵母提取粉。PB实验表明,甘油、玉米粉和酵母提取粉是影响烟曲霉素产量的主要因素;BBD实验优化得到产烟曲霉素的适宜培养基成分为:甘油33.5 g/L、酵母提取粉3.1 g/L、玉米粉1.7 g/L、Mg SO_4·7H_2O 0.5 g/L、K_2HPO_41.5 g/L、KCl 0.5 g/L、Fe SO_4·7H_2O 0.013 g/L。以此培养基发酵144 h测得发酵液中烟曲霉素含量达到68.51 mg/L,较优化前提高了122.4%。结论:实验优化了发酵烟曲霉素的培养基成分,显著提高了烟曲霉CEA-1701菌株合成烟曲霉素产量,为烟曲霉素的发酵生产提供了参考依据。

摘要：烟曲霉(Aspergillus fumigatus)是临床上重要的条件致病性真菌之一,造成侵袭性感染时死亡率很高.传统的诊断方法尚有不少难点,如形态学鉴定费时,抗原检测敏感性低等.我们采用基因检测路线,设计出烟曲霉特异性引物,结合巢式聚合酶链反应的方法,对烟曲霉基因检测进行了初步探讨 [1,2].

摘要：目的建立检测烟曲霉DNA的荧光定量PCR方法,评价其在小鼠侵袭性烟曲霉肺部感染诊断中的意义。方法根据烟曲霉ITS1区域基因组序列,设计合成引物和荧光标记探针,优化荧光定量PCR条件,从特异性、扩增效率、灵敏度及重复性方面进行评价。建立小鼠烟曲霉肺部感染模型,用荧光定量PCR对36只实验小鼠肺组织及支气管肺泡灌洗液(bronchoalveo-lar lavage fluid,BALF)进行检测。结果本研究设计的引物和探针特异性扩增烟曲霉DNA,最低检出量为每毫升102个烟曲霉孢子,在103～107拷贝数(Cp)内具有良好的线性关系(R2=0.999)。在0.5×103 Cp/mL与0.5×105 Cp/mL两个浓度时,批内变异系数为0.39%、0.53%,批间变异系数为2.22%、4.58%。结论成功建立了荧光定量PCR检测烟曲霉DNA方法,该法特异性强、灵敏度高、重复性好,将有助于烟曲霉感染的早期诊断和针对性治疗。

摘要：为了对白色念珠茵和烟曲霉实现快速检测，分别设计特异性引物，建立了白色念珠菌和烟曲霉SYBR Green I双重荧光定量PCR检测方法。结果显示，该方法灵敏度高，对白色念珠菌和烟曲霉的最低检出量分别为4．34×10CFU／mL和3．76×10CFU／mL；重复性好，批内变异系数均小于1％；特异性强，与黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、塔宾曲霉、光滑念珠茵、克柔念珠茵、热带念珠茵、近平滑念珠菌等病原真菌无交叉反应；耗时短．只需2h即可完成整个试验过程，可同时检测白色念珠菌和烟曲霉。上述结果表明，该方法可应用于白色念珠菌和烟曲霉感染的快速检测。

摘要：目的:根据烟曲霉Mto1基因特异位点设计并合成探针及引物,建立应用实时荧光PCR检测烟曲霉的方法。方法:通过对多种病原曲霉Mto1基因序列的比对分析,在烟曲霉特异位点设计引物及探针,并对其进行特异性及敏感性进行验证。结果:通过对曲霉属26株不同曲霉菌及其他属的6株不同病原真菌的特异性验证未发现有交叉反应,敏感性实验显示应用该方法可检出1.08×10-6μg/ml的模板DNA。结论:实验建立了应用实时荧光PCR技术检测烟曲霉的方法,该方法具有特异、灵敏、快速等特点并能有效避免普通PCR中的样品间交叉污染问题。

摘要：目的建立实时定量PCR（RQ-PCR）快速检测人全血标本中烟曲霉基因组载量的方法及进行初步临床应用。方法基于烟曲霉多拷贝基因ITSl-5．8S基因设计引物和TaqMan探针，用QIAamp^DNA Blood Mini Kit提取烟曲霉基因组DNA，建立20μlRQ-PCR反应体系，对含有不同载量烟曲霉基因组的模拟人全血标本和66份外科发热患者全血标本进行烟曲霉基因组的定量检测。结果检测限为10^-1基因组／μl上机待测液（即约78CFU／ml全血）；检测特异度和灵敏度分别为94．25％和99．04％，阳性预告值和阴性预告值分别为97．63％和97．62％；测定结果的平均相对误差为（3．67±13．19）％；批内及批间平均重复性变异系数分别为（12．38±1．53）％和（16．27±2．72）％；人血标本中烟曲霉基因组平均回收率为（107．81±25．92）％，回收率平均变异系数为（26．24±5．62）％。66份外科发热患者血标本中未检测出烟曲霉基因组。结论RQ-PCR可以快速、特异、灵敏地定量检测人血标本中烟曲霉基因组的载量，且有着较好的准确度与精密度。本研究外科发热患者血中未检测到烟曲霉基因组。

摘要：探究烟曲霉羊毛甾醇14α-去甲基化酶活性位点的结构特征.首次采用同源建模的方法构建了烟曲霉羊毛甾醇14α-去甲基化酶的三维结构,并通过Ramachandran和Profile-3D图验证了模型的可靠性.然后,利用已知的共结晶配体结构,准确定位了14α-去甲基化酶的活性位点,让伏立康唑与靶点进行对接.通过柔性分子对接方法首次阐明了14α-去甲基化酶抑制剂与靶酶活性位点的相互作用模式,明确了14α-去甲基化酶与该类抑制剂结合时起重要作用的氨基酸残基.本研究为基于烟曲霉14α-去甲基化酶三维结构的药物靶点设计提供重要的参考信息,同时也为抗真菌药的发展奠定坚实的理论基础.

摘要：为了获得适宜的烟曲霉素发酵条件,提高烟曲霉素产量。以烟曲霉CEA-1701为生产菌株,运用HPLC测定烟曲霉素含量。通过单因素试验确定各因素范围,进一步运用Plackett-Burman(PB)和Central-Composite Design(CCD)设计优化适合烟曲霉CEA-1701产烟曲霉素的发酵条件,最后对优化的结果进行5L罐的扩大培养。PB试验表明,温度和p H是影响烟曲霉素产量的主要因素;CCD优化得到的产烟曲霉素的发酵条件为:温度32℃、培养基初始p H 6.24、装液量50/250m L、接种量1%(v/v)、玻璃珠添加量5颗。以优化后的条件进行摇瓶和5L发酵罐发酵,烟曲霉素的产量分别提高了18.7%和34.6%,达到73.58mg/L和83.42mg/L。试验优化了烟曲霉CEA-1701产烟曲霉素的发酵条件,初步得到了5L发酵罐的发酵参数,扩大培养显著提高了烟曲霉素的产量。为烟曲霉素的进一步发酵生产提供了依据。

摘要：目的融合PCR是一种常用的构建重组片段或重组质粒的手段,但长片段融合PCR的难度较大。文中将探讨长片段融合PCR过程中引物设计及扩增条件对产物的影响。方法以构建烟曲霉rho 1基因回补株为例,采用融合PCR的方法扩增重组片段(长达6.5 kb),在引物设计时引入不同大小的同源区,并设置不同的扩增体系。结果当设计引物的同源区为35 bp,选用具有高扩增效率、高保真性的DNA聚合酶,以及各片段在融合PCR反应体系中的浓度为15 ng/μL时,实现了长达6.5 kb的片段扩增并完成了烟曲霉rho 1回补株的构建。结论在合适的PCR引物设计、片段浓度配比及聚合酶条件下,长片段融合PCR在丝状真菌的基因敲除及回补株的构建中是一种非常有效的工具。