摘要：目的针对肝纤维化发病关键基因热休克蛋白47(HSP47)基因构建HSP47-shRNA,初步验证其在NIH/3T3细胞系干预HSP47基因的表达,影响HSP47 mRNA及蛋白水平表达,并观察该细胞功能学变化。方法设计HSP47-shRNA模板,并将其分别设计于U6启动子的下游引物,将U6启动子及其下游HSP47-shRNA的模板双链DNA连接入载体,构建HSP47-pGCsi-U6-shRNA重组质粒(HSP47-1-pGCsi-U6-shRNA、HSP47-2-pGCsi-U6-shRNA和HSP47-3-pGCsi-U6-shRNA)。以非相关干扰质粒作为对照,通过脂质体介导转染HSP47-shRNA至小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)中,分别于12、24、48和72h在倒置荧光显微镜下观察细胞转染效率和荧光表达强度;同时于转染后0、24和48h收集细胞,采用RT-PCR和蛋白质印迹(Western blotting)分析HSP47 mRNA和蛋白表达情况;并观察干预后该细胞分泌胶原功能和小鼠转化生长因子(TGF-β1)表达的变化。结果成功构建HSP47-shRNA载体,通过脂质体介导转染入NIH/3T3细胞,各干扰质粒转染效率均约为60.0%,各干扰质粒转染效率间差异无统计学意义(P>0.05)。转染12 h,可见少量绿色荧光细胞,随转染时间的延长,细胞荧光表达量逐渐增加,各干扰质粒于转染72h荧光表达最强。shRNA干扰显著抑制HSP47蛋白的表达,以转染HSP47-1-shRNA 24h后对蛋白表达抑制效果最佳,对HSP47 mRNA的相对沉默效率为(25.83±1.79)%,与空白组及非相关对照组比较,差异有统计学意义(P0.05)。各组HSP47-shRNA干扰质粒对TGF-β1 mRNA的抑制效率以转染24 h效果最佳,相对表达分别为(63.23±2.18)%、(64.53±3.17)%和(75.19±4.20)%,均低于空白组和非相关对照组(P0.05)。各HSP47-shRNA干扰质粒组细胞上清中TGF-β1的抑制率以转染24h为最佳,分别为(51.79±3.12)%、(66.67±2.13)%和(69.61±3.65)%,与空白组相比,HSP47-1-shRNA组与HSP47-2-shRNA组对TGF-β1均有显著抑制作用,且以HSP47-1-shRNA组抑制效率更佳(P0.05)。结论构建了HSP47-shRNA干扰质粒,初步证实其对HSP47的表达干预有效,并引起NIH/3T3细胞功能学的变化。

摘要：目的:探究热休克蛋白47(HSP47)siRNA对体外培养人眼Tenon囊成纤维(HTCF)细胞生物学行为及转化生长因子-β1(TGF-β1)表达水平影响。方法:体外培养HTCF细胞,并分为:空白对照组、空载体组和转染组;转染组根据HSP47基因序列设计并合成干扰siRNA序列,构建载体并导入HTCF细胞中;空载体组导入空白载体。采用RT-PCR和蛋白质印迹实验检测细胞中HSP47 mRNA和蛋白的表达情况,采用克隆形成实验、流式细胞术、Transwell法及划痕实验检测细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移,蛋白质印迹实验检测增殖、凋亡、侵袭、迁移蛋白和TGF-β1的表达情况。结果:相比空载体组,转染组HSP47 mRNA和蛋白的表达、克隆形成率、细胞愈合率、侵袭细胞数目、Ki67、N-cadherin、TGF-β1蛋白相对表达水平显著降低(P0.05)。结论:HSP47 siRNA可以通过抑制TGF-β1蛋白的表达降低HTCF细胞的增殖、侵袭及迁移能力,但对HTCF细胞的凋亡无明显影响。

摘要：目的:构建小鼠热休克蛋白47(47 kDa heat shock protein,HSP47)基因的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)表达载体,及HSP47第一外显子克隆表达载体,观察其在小鼠成纤维细胞(NIH3T3细胞株)中对HSP47基因表达的抑制作用。方法:针对小鼠HSP47的mRNA序列,在368、718位点分别设计两对21nt的,编码HSP47siRNA基因片断的寡核苷酸,退火成双链后将其连接到pSilencer1.0质粒的U6启动子下游,构建pSilencer-HSP47siRNA重组质粒;同时构建HSP47第一外显子重组质粒。经酶切、测序鉴定后,用脂质体介导的基因转染方法,转入NIH3T3细胞,用半定量RT-PCR法检测HSP47表达水平的变化。结果:经酶切、测序鉴定,成功构建了siRNA真核表达载体及靶基因克隆表达载体。经脂质体转染NIH3T3细胞后,RT-PCR显示NIH3T3细胞中HSP47基因的mRNA表达水平明显降低,所构建的HSP47-siRNA基因的真核表达载体,成功地抑制了目的基因的表达。结论:构建的小鼠HSP47基因的RNA干扰真核表达载体pSilencer-HSP47siRNA,在NIH3T3细胞中有效地发挥了对HSP47基因表达的干涉作用,从而提示HSP47特异的siRNA具有抑制皮肤瘢痕形成的潜力。