摘要：根据从实验室克隆的牙鲆抗菌肽hepcidin基因（GenBank登陆号DQ129693）的序列,设计了特异性引物,PCR扩增其成熟肽片段.重组至融合表达载体pGEX-4T-1中,构建成牙鲆抗菌肽hepcidin基因融合表达载体pGEX-fhep,转化至大肠杆菌BL21（DE3）plyS中,筛选得到的阳性克隆用IPTG进行诱导.SDS-PAGE电泳显示在29kD处有特异性的蛋白条带出现,Western-blotting 检测表明已经成功表达了融合蛋白,表达的融合蛋白最高占总蛋白的21%.纯化得到的GST-fhep用凝血酶切割后,用亲合层析得到牙鲆的抗菌肽hepcidin.抑菌实验结果表明抗菌肽对大肠杆菌（ATCC25922）有一定程度的抑制作用.

摘要：以一个牙鲆养殖群体中的100个个体为实验材料，根据其生长激素（GH）基因的五个外显子序列设计引物，进行PCR扩增，通过SSCP分析技术对其进行检测，结果表明该群体生长激素基因的第四个外显子存在多态性。共检测到两种基因型，其中AA型个体占88％，AB型个体占12％；DNA测序结果表明，AB型在第1763位发生碱基突变，c→t，与AA型同源性达到99％，同时发现不同基因型的个体在体重和头长上表现出显著的差异（P〈0．05）。上述结果表明利用PCR-SSCP技术可以检测到牙鲆生长激素基因外显子部分存在序列遗传多态性，且该多态性与其生长的某些性状具有一定的连锁关系，为将来进行标记辅助选育奠定了基础。

摘要：采用同源克隆的方法设计简并引物从牙鲆（Paralichthys olivaceus）肝脏中克隆了牙鲆hepcidin抗菌肽基因。牙鲆抗菌肽hepcidin基因组DNA全长821bp，序列分析表明该基因具有3个外显子和2个内含子。cDNA全长588bp，包含一个270bp的开放阅读框，编码一个长89氨基酸的前体肽。RT-PCR分析表明：该抗菌肽基因在正常牙鲆的肝脏、头肾、鳃、脾脏中表达量较高，在心脏、小肠中表达量较低；受到病原鳗弧菌感染的牙鲆各组织该基因表达量明显上升。牙鲆抗菌肽基因的克隆为水产养殖等领域的抗耐病品种的选育提供了基因源，为开发新的生物工程药物提供了基础理论和实验数据。

摘要：采用生物素-磁珠吸附微卫星与质粒二次检测相结合的方法克隆牙鲆微卫星,并利用所得到的引物分析野生群体遗传结构。共获得2805个阳性克隆,测序得到3120个含微卫星的序列。其中完美型、非完美型和混合型分别占57.97%、7.25%和34.78%。用Primer3.0软件设计牙鲆微卫星引物,从中筛选出具稳定多态性的30对,分析中国黄海、渤海海域4个不同海区牙鲆野生群体(大连、北戴河、丹东、青岛)遗传结构。结果显示:有效等位基因数为3.93～9.94,平均为6.95;观测杂合度为0.532～0.895,平均为0.753;期望杂合度为0.635～0.902,平均为0.820;Hardy-Weinberg平衡指数(d)的变化范围为-0.247～0.512,其中7个位点表现为杂合子过剩(d>0),其余位点表现为杂合子缺失(d<0)。聚类分析显示:4个群体聚为两类,大连与丹东聚为一类,北戴河与青岛聚为一类。

摘要：为了探讨牙鲆MHC-DAA等位基因的多态性,根据牙鲆(Paralichthys olivaceus)MHC-DAA的cDNA序列设计特异引物,扩增内含子序列。牙鲆DAA基因由4个外显子和3个内含子组成,与大西洋鲑(Salmo salar)DAA基因结构相同,在内含子2中存在一个高度多态的微卫星位点(GT)n。根据获得的MHC-DAA基因组序列设计特异性引物,在45尾牙鲆中扩增了包括完整外显子2和内含子2的长度约670bp的DNA片段,克隆测序后共发现30个MHC-DAA等位基因,各等位基因的频次及其各主型中亚型的数目都不均衡。在249bp的外显子2序列中共有55个位点发生变异,核苷酸多样性指数为0.0887,编码的氨基酸序列中多态变异位点31个,其中简约信息位点30个,单变异位点1个。非同义替代与同义替代的比率在PBR(Peptide binding region)和非PBR结合区分别为3.30和2.43,分析证明平衡选择是牙鲆存在众多DAA等位基因的发生机制。

摘要：本研究利用实验室已建牙鲆(Paralichthysolivaceus)转录组数据库,得到牙鲆JNK2基因(Po JNK2)并利用PCR技术进行序列验证。PoJNK2的开放阅读框长度为1263 bp,编码420个氨基酸;通过SMART服务器对PoJNK2的结构域进行预测,显示PoJNK2具有典型的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶催化结构域S_TKc。利用q RT-PCR分析PoJNK2在牙鲆成体不同组织中的表达水平,发现其在牙鲆免疫组织中均有表达,因此,初步推测PoJNK2在牙鲆免疫应答方面可能发挥作用。本研究设计了体内迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)侵染实验和体外免疫刺激细胞实验以探究PoJNK2在牙鲆免疫反应中的作用。在迟缓爱德华氏菌体内注射牙鲆成体后,PoJNK2在脾脏、头肾和鳃中有不同程度的表达上调。同时,使用迟缓爱德华氏菌、Poly I:C和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激牙鲆鳃细胞系后,发现PoJNK2在不同时间点表达上调。除此之外,通过细胞转染实验在牙鲆鳃细胞系中过表达PoJNK2,发现其对下游炎症细胞因子的表达及激活蛋白Activator protein-1 (AP-1)的转录活性具有显著的上调作用,进一步阐明了PoJNK2在调节牙鲆免疫应答方面的作用。

摘要：本研究利用实验室已建牙鲆(Paralichthys olivaceus)转录组数据库预测得到牙鲆NOD2基因(PoNOD2),并利用PCR技术进行序列验证。同时,设计迟缓爱德华氏菌注射感染牙鲆成鱼和体外免疫刺激牙鲆鳃细胞系实验,探究PoNOD2基因在抗菌免疫反应中的作用。PoNOD2基因的开放阅读框长度为2964 bp,编码988个氨基酸。PoNOD2蛋白有3种保守结构域,包括C-末端LRR,中心NACHT和N-末端CARD结构域。实时荧光定量PCR结果显示,在所检测牙鲆组织中,迟缓爱德华氏菌的侵染能显著上调PoNOD2的表达。体外免疫刺激牙鲆鳃细胞系实验显示,在PGN、PolyⅠ:C和迟缓爱德华氏菌刺激下,PoNOD2表达上调。亚细胞定位显示,PoNOD2蛋白定位于牙鲆鳃细胞的细胞质中。在迟缓爱德华氏菌侵染牙鲆鳃细胞过程中,PoNOD2基因的过表达能够抑制细菌生长,并引起IL-1β、IL-6和IL-8等炎性细胞因子的表达上调。结果表明,PoNOD2在抑制迟缓爱德华氏菌生长以及调节牙鲆对病原菌的免疫应答中发挥重要作用。

摘要：β诺达病毒利用其缺乏校正功能的聚合酶进行基因组复制,易导致突变,因而具有广泛的宿主感染性,而且可引发致死率极高的病毒性神经坏死症,需要有针对性地研究检测及防御方法。本研究以感染牙鲆(Paralichthys olivaceus)的β诺达病毒为对象,利用引物设计,将His标签编码序列连接到完整病毒衣壳蛋白C端,构建原核表达载体;采用SDS-PAGE及质谱对表达产物进行分离和鉴定;重组衣壳蛋白经镍离子亲和柱纯化后进行复性条件的正交优化。结果表明4个肽段经质谱鉴定与预期一致;纯化产物产量可达36mg/L;4°C条件下,复性缓冲液中尿素和PBS的最适浓度为0.8mol/L和0.05mol/L。本研究建立的制备方案可为研制相关疫苗以及开发针对该病毒的快速检测产品等提供有价值的参考。

摘要：随着近海渔业资源的日趋衰竭,在异军突起的海水鱼类养殖中,牙鲆鱼成为室内工厂化及室外网箱养殖的重要对象.山东省日照市东港区石臼街道,根据当地沿海滩涂的特点,设计出一种实用有效的养殖新方法--岩礁带滩涂蓄池养殖,并取得了理想的效果,现将技术环节介绍如下:

摘要：设计特异引物,以SMARTcDNA为模板,应用PCR方法扩增牙鲆钙调素基因(Paralichthys olivaceus calmodulin,PoCaM)。计算机辅助分析表明,PoCaM基因编码149个氨基酸的推定蛋白,其分子量为17kD,等电点为3.93,含有4个螺旋-环-螺旋样结构,与其它鱼类CaM氨基酸一致性为97.3%-100%。构建原核表达重组质粒pET32a/PoCaM,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE蛋白电泳,结果显示PoCaM在大肠杆菌中进行了特异性融合表达,融合蛋白分子量约为34kD,与预期分子量大小一致。同时,以绿色荧光蛋白(GFP)为表达标签,构建真核表达重组质粒pEGFP-N3/PoCaM,经Lipofectamine 2000介导转染鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprinid,EPC),荧光显微镜观察显示,PoCaM在EPC细胞中进行瞬时表达,主要分布于细胞核及胞浆中。