摘要：牛库布病毒(bovine kobuvirus,BKoV)可能是一个腹泻相关病原,目前还没有检测该病毒的实时荧光定量RT-PCR方法的报道。依据BKoV 3D核苷酸序列,采用Primer 6.0设计了一对引物,通过优化反应条件和反应体系,成功建立了检测BKoV的TB Green染料法实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示此方法在4.86×10^8~4.86×10^2 copies·μL^-1病毒浓度之间具有良好的线性关系,相关系数为0.9995,扩增效率为92.75%;此方法只特异性检测BKoV,而与其他常见的腹泻病原没有交叉反应;组内及组间的变异系数均小于2%;最低检测下限为4.86×10^2 copies·μL^-1。本研究所建的实时荧光定量RT-PCR方法对奶牛和牦牛腹泻粪便样本中BKoV的检出率明显高于已报道的3篇有关RT-PCR方法。对2018年5月—2019年5月采集自青藏高原地区(青海、西藏和四川藏区)的131份牦牛腹泻粪便样本进行检测,结果显示BKoV检出率为31.30%。首次成功建立了检测BKoV的实时荧光定量RT-PCR方法,具有良好的特异性和稳定性,且灵敏度高,为BKoV的检测及流行病学调查提供了一种新的技术手段;并且首次证实BKoV在牦牛中的流行,为牦牛腹泻的防控问题提供了参考。