摘要：【背景】牛支原体(Mycoplasma bovis)是引起牛乳房炎、关节炎及呼吸道疾病等的重要病原体之一,严重危害养牛业的健康发展。【目的】建立一种便捷、快速、灵敏和特异的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术结合横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)方法用于牛支原体的检测。【方法】对牛支原体P48特异性基因序列进行对比,选择保守性区域。运用Primer Explorer V5在线软件设计引物,并通过荧光染料法与以oppD/F、oppD、urvC为靶基因所设计的LAMP引物进行比较。对筛选出的最佳P48引物组的内引物(FIP/BIP)用生物素和6-羧基荧光素标记;利用单一控制变量法对反应温度、时间与引物浓度比进行优化;将LAMP检测方法与LFD相结合。最后评价该方法的敏感性、特异性、重复性及临床应用效果。【结果】P48 LAMP引物组荧光信号更强,Ct值较小,扩增效率较高,优于已报道的LAMP引物组;当反应温度为60℃、引物(F3/B3:FIP/BIP)浓度比为1:4、反应时间为40 min时最佳;最低检测浓度为17.28 fg/μL,比行业标准PCR检测方法灵敏1000倍;与多杀性巴氏杆菌、牛疱疹病毒等9种引起牛呼吸道疾病相关病原体均无交叉反应;批间与批内试验均一致;运用该方法对39份临床鼻拭子的检出率为28.21%,高于行业标准的PCR法(检出率23.07%)。【结论】成功建立一种敏感、特异以及便于基层使用的牛支原体LAMP-LFD检测方法,为防控牛支原体病提供了技术支持。

摘要：参照GenBank中牛支原体PG45株二氢硫辛酸脱氢酶基因(pdhD)的序列设计特异性引物,应用PCR扩增牛支原体武威株的pdhD基因,然后将其克隆至pMD19-T。在完成测序及点突变的基础上构建重组表达质粒pET-28a(+)-pdhD,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后纯化表达产物His-DLD,并对其酶促反应活性进行测定。结果显示,表达产物在底物NADH存在条件下,能将硫辛酰胺催化生成二氢硫辛酰胺,且其最适酶促反应温度为25℃、pH为7.5;其米氏常数Km(NADH)为9.72μmol/L,最大反应速率为25.6μmol/(L·min)。上述结果为研究二氢硫辛酸脱氢酶的生物学功能奠定了基础。

摘要：本研究旨在建立一种可一次性区分牛支原体、丝状支原体丝状亚种小克隆和无乳支原体的三重PCR诊断方法,为临床诊断和流行病学调查提供可靠检测技术。根据GenBank发表的上述3种病原的基因组序列保守区域设计3对特异性引物建立三重PCR方法;确定其检测敏感性,以猪支原体、鸡支原体、无乳支原体和丝状支原体丝状亚种小克隆基因作模板检验其特异性;同时和病原分离鉴定结果对比其准确性。结果表明在优化体系和条件下能够同时得到扩增长度为448、549、375 bp 3条特异性片段,未扩增出猪、鸡支原体模板特异性片段;其敏感性(可检测到的最小模板DNA含量)为0.8 ng.μL-1;36份临床样品检测结果显示,三重PCR检测结果与分离培养鉴定方法一致,均能鉴定出牛支原体阳性病料。本研究建立的三重PCR诊断方法能够一次性鉴别3种支原体,具有高敏感性、特异性和准确性,可用于临床诊断和流行病学调查。

摘要：旨在探究牛支原体(Mycoplasma bovis,Mb)NADH氧化酶NOX2的生物学功能,本研究参照GenBank中Mb湖北分离株(Mb Hubei-1 strain)nox2基因序列设计引物,应用PCR扩增获得Mb临洮分离株的nox2基因,在测序及序列优化的基础上,构建原核表达载体pET-nox2,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中诱导表达,进而对表达产物rMbNOX2的酶促活性、免疫原性,NOX2在Mb内的分布,rMbNOX2抗血清的补体介导体外杀菌活性和对Mb黏附宿主细胞的抑制活性进行了分析。结果表明,Mb临洮株nox2基因全长1350 bp,与GenBank中已知序列的Mb nox2基因序列比较,除Mb JF4278株相似性为97.93%外,其余均为99.93%。SDS-PAGE结果显示,优化的nox2基因在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白rMbNOX2相对分子质量约为67 ku,且具有良好的酶促活性;ELISA与Western blot结果显示,rMbNOX2具有良好的免疫原性,且Mb NOX2在细胞浆中的分布多于细胞膜;补体介导的体外杀菌试验及黏附抑制试验证实,rMbNOX2抗血清具有明显的补体介导杀支原体活性,并可有效抑制Mb对宿主细胞的黏附。本研究为深入探讨Mb NOX2生物学功能奠定了基础。

摘要：为建立一种对牛支原体高效、快捷的可视化重组酶聚合酶扩增(LFD-RPA)临床诊断方法,以牛支原体uvrc基因序列为靶基因,设计特异性引物和探针,通过筛选引物和探针、优化反应条件,并通过灵敏度、特异性、重复性和临床样本检测试验进行验证。结果显示,该试验建立的牛支原体LFD-RPA最佳引物为F2/R2,最佳反应条件为39℃、 25 min;检测灵敏度可达2.08 copies·μL^(-1),是普通PCR灵敏度的100倍;与滑液囊支原体、沙门氏菌、绵羊肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和产气荚膜梭菌之间无交叉反应;重复性稳定;对50份鼻拭子样本进行检测,阳性率为26%,与我国行业标准PCR检测方法的符合率为89.6%。该试验成功建立了牛支原体LFD-RPA检测方法,该方法具有操作简便、快速、高效、敏感等优点,为牛支原体的临床快速诊断提供了技术支撑。

摘要：试验旨在分析牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列,并探究其序列特征及编码蛋白的结构和功能。根据GenBank中PG45菌株oppD/F基因序列(登录号:AF130119.1)设计1对引物,应用PCR技术扩增获得分离株oppD/F基因,将oppD/F基因片段克隆至pMD19-T载体中进行测序,在采用生物信息学方法分析其核苷酸序列的基础上对其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、可溶性、信号肽、跨膜域、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构和功能等进行分析和预测。结果显示,牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列全长1617 bp,与Mb PG45株和Mb JF4278株的同源性均为100%,处于同一分支;该基因编码蛋白是由539个氨基酸残基组成,不存在信号肽及跨膜结构,是一种稳定的亲水性蛋白质;oppD/F蛋白存在1个AAA家族结构域,50个潜在的磷酸化位点和3个糖基化位点,其二级结构是混合型,其中α-螺旋所占比例最高(61.78%),无规则卷曲次之(20.78%)。功能预测结果显示,oppD/F蛋白在信号传导、受体、结构蛋白、离子通道、免疫应答和胁迫应答等方面的几率均较高。本研究结果为进一步分析牛支原体oppD/F基因的功能提供了一定的理论依据。

摘要：牛支原体(Mycoplasma bovis)是一种重要的兽医病原体,牛支原体感染给当前世界养牛业造成了重大的经济损失。本文从天然免疫、体液免疫和细胞免疫三个方面,对宿主感染牛支原体后的免疫应答特点进行了概括和讨论,可帮助我们更好地了解牛支原体与宿主的相互作用,也为合理地设计和研发有效的牛支原体感染防控技术提供参考。

摘要：牛支原体(Mycoplasma bovis,***)是一种造成全世界范围内育肥牛和奶牛多种疾病综合征的重要病原体。临床症状主要包括长期性肺炎及多发性关节炎(CPPS)、呼吸道疾病综合征(BRD)、乳腺炎及生殖器官疾病。牛支原体能感染多种组织和器官,也能从健康的牛体内分离,是威胁畜牧业生产的主要病原体。由于临床上抗生素治疗效果不佳,预防或控制牛支原体感染最好的选择是研发有效的商业可用的疫苗。牛支原体疫苗的研究已历经多年,虽然存在很多问题,但也取得了一定进展。文章对牛支原体弱毒疫苗、灭活疫苗及亚单位疫苗的研究进展进行了总结,并讨论了疫苗设计的优化方案,为合理设计和研发有效的牛支原体防控技术提供参考。

摘要：为建立一种可同时检测牛支原体(MB)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛传染性支气管炎病毒(IBRV)的三重二温式PCR检测方法。根据GenBank中MB、BVDV和IBRV的保守基因Uvrc基因、5′端非编码区(5′-UTR)和GB基因,分别设计了3对特异引物,将三温式PCR扩增程序简化为两个温度梯度,优化反应条件建立了用于同时检测MB、BVDV以及IBRV 3种常见牛呼吸道传染病病原的三重二温式PCR。结果显示,该方法特异性好,只对MB、BVDV和IBRV模板进行扩增,扩增的目的片段长度分别为412、170、727bp,对其他牛病原体无特异性扩增;灵敏度高,最低能同时检测到10 000拷贝的目的核酸;干扰性小,能同时检测3个不同浓度的模板。研究所建立的MB、BVDV和IBRV三重二温式PCR检测方法,具有特异性好、灵敏度高、方便快速等优点,可用于临床鉴别诊断和流行病学调查,具有很高的临床应用价值。

摘要：为建立检测牛支原体(M. bovis)的微滴式数字PCR(ddPCR)方法,本研究以牛支原体uvrC基因为靶基因,设计特异性引物和探针,采用方阵法对ddPCR退火温度、引物和探针浓度的优化,结果显示,建立的ddPCR方法最佳退火温度为62.6℃,最佳引物和探针终浓度分别为900 nmol/μL和250 nmol/μL。利用该方法检测M. bovis、牛传染性鼻气管炎病毒、牛鼻炎病毒B型、副结核分枝杆菌、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛轮状病毒等,结果显示仅能够特异性检测到M. bovis,对其他病原均无交叉反应,特异性强;分别以10倍倍比稀释(1.2×10^(4)拷贝/μL~1.2×10^(-2)拷贝/μL)后的重组质粒标准品pMD19-T-uvrC为模板,进行敏感性试验,结果显示该ddPCR方法的检测下限为1.2拷贝/μL,是荧光定量PCR方法敏感性的10倍,该ddPCR敏感性高;对该ddPCR进行组内和组间重复性试验,结果显示其组内和组间变异系数均小于5%,重复性好。取23份来自患有乳房炎奶牛的新鲜牛奶和40份来自有呼吸道症状的牛鼻拭子样品,分别通过ddPCR、病原分离鉴定和荧光定量PCR方法检测M. bovis,结果显示,阳性率分别为42.86%(27/63)、33.33%(21/63)和33.33%(21/63),该ddPCR敏感性高于病原分离鉴定和荧光定量PCR方法,ddPCR方法与上述两种方法的符合率均为62.9%。本研究建立的ddPCR方法灵敏度高、特异性强,可对牛支原体进行定量检测,为牛支原体感染的早期监测和精准检测提供了可行技术手段。