摘要：本实验建立了一种能够同时快速检测牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛支原体的三重荧光PCR。分别以牛传染性鼻气管炎病毒gB基因、牛病毒性腹泻病毒的5'-UTR基因和牛支原体的P48基因为靶基因设计了特异性引物和TaqMan探针,建立了多重实时荧光PCR方法,并对该方法的灵敏度、特异性、重复性等进行了验证,同时对临床样本进行了检测。结果表明,该方法灵敏度高能够检测出低至10个拷贝数的样本、特异性强、重复性好,并且成本低,与其它牛病原体无交叉反应,对临床样本的检测优于国家标准方法。该方法适合大量临床样品的检测和疫情监控,为牛呼吸道疾病的病原微生物鉴定和降低养殖经济损失提供科学可靠的方法。

摘要：为了提高牛呼吸疾病综合征多病原混合感染的临床诊断效率,以牛支原体(Mycoplasma bovis,M.b)oppD/F基因、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,P.m)ompH基因、溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,M.h)gcp基因、牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gB基因、牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)以及牛副流感病毒(bovine parainfluenza virus type,BPIV) 3型a和c基因型(BPIV-3a,-3c)的N基因等为检测靶标,分别设计特异性引物和Taqman探针,通过优化反应条件,采用3管7联的组合方式建立了7种病原体的多联实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法仅对本试验的7种病原有特异性反应,与其他常见病原无交叉反应。对M.b、P.m、M.h、IBRV、BRSV、BPIV-3a和BPIV-3c质粒标准品的最低检测限分别为102、102、101、102、102、102和101拷贝/μL。组内变异系数小于2.5%,组间变异系数小于5.5%。平行应用该方法和常规PCR方法对临床采集的115份有呼吸道症状牛的鼻拭子进行检测,P.m阳性率36.65%,M.b阳性率27.83%,M.h阳性率25.22%,IBRV阳性率11.30%,BPIV-3c阳性率8.57%,BRSV阳性率0.95%;其中混合感染率为26.1%。共检测到11种混合感染模式,主要由M.b与其他病原体的混合感染,占72.7%(8/11);M.b/P.m混合感染的检出率最高,占60%(18/30);M.b、P.m、M.h在混合感染中出现率排前三,其占比分别为73.3%(22/30)、73.3%(22/30)和43.3%(13/30);其次为IBRV,占26.7%(8/30);BPIV-3c占13.3%(4/30)。以上结果表明,该方法具有较高的分析敏感性和特异性,可用于牛呼吸疾病综合征多病原感染的联合检测。

摘要：为建立牛呼吸道疾病综合征3种常见病原菌多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)和牛支原体(Mycoplasma bovis)的三重TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据3种病原菌的16S rRNA基因序列设计特异性引物和探针,通过反应体系和扩增程序优化,建立了3种病原菌的三重TaqMan荧光定量PCR检测方法。特异性试验结果显示,利用建立的方法对多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌和牛支原体DNA样品的检测为阳性,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠道沙门菌等牛常见24种细菌DNA样品的检测为阴性,表明该方法特异性较强;敏感性试验结果显示,该方法对重组质粒pMD-Past、p MD-Mann和p MD-Myco的最低检出限分别为38、45和28 copies/μL,表明该方法敏感性较高;重复性试验结果显示,该方法变异系数≤2.15%,表明该方法重复性较好。利用建立的三重TaqMan荧光定量PCR方法和文献报道的TaqMan荧光定量PCR方法平行检测43份呼吸道疾病病牛的DNA样品,结果显示,两种方法检测多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌和牛支原体的总符合率分别为100%、97.7%和100%。结果表明,本研究建立的三重TaqMan荧光定量PCR方法为牛呼吸道疾病综合征3种常见病原菌的高通量快速检测提供了有效的技术支撑。

摘要：为了同时检测奶牛乳房炎多种病原菌,试验采用金黄色葡萄球菌(***)nuc基因、牛支原体(***)oppD/F基因、大肠杆菌(***)16S-23S rRNA基因内转录间隔区作为靶标设计3对特异性引物,在优化单菌退火温度的基础上确定多重PCR的退火温度,建立***、***和***的多重PCR检测方法,验证多重PCR的重复性、特异性、敏感性及实用性。结果表明:基于单一PCR三者共同的最佳退火温度(55.3℃、56.5℃、57.8℃)优化多重PCR退火温度,最终确定57.8℃为三者最佳的退火温度。该方法能扩增出长度为237 bp(***)、333 bp(***)、634 bp(***)的基因片段;靶标菌特异性扩增而非靶标菌无扩增条带,最低检测浓度分别为*** 1 pg/μL、*** 1 pg/μL、*** 100 fg/μL;正常乳样和临床乳房炎乳样均检出***(25.9%、53.8%)、***(10.3%、17.9%)和***(32.8%、71.8%),但乳房炎乳样的阳性检出率高于正常乳样。说明本研究建立的多重PCR方法特异性和敏感性强、稳定性和实用性高,具有良好的推广应用前景。

摘要：本研究根据牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛支原体(MB)的保守基因设计了两对特异引物,建立了可同时检测IBRV和MB的二温式多重PCR检测方法。结果表明,IBRV和MB的扩增长度分别为727bp和412bp,而其他对照病毒的检测结果均为阴性;该方法的IBRV和MB标准品最低检测限均为104拷贝。