摘要：旨在解析我国牛流行热病毒(BEFV)分离株HN1/2012的基因组特征,为阐明我国BEFV毒株的演化规律提供数据。根据GenBank中收录的BEFV毒株的全基因组信息,设计引物,以RT-PCR扩增11段相互部分重叠的DNA片段,克隆至pGEM T-easy载体,分别进行测序,利用DNAStar软件进行序列拼接获得HN1/2012株的全基因组序列。根据BEFV编码基因的转录起始(TI)和转录终止/多聚腺苷酸化(TTP)序列分析获得各基因序列及其开放阅读框(ORF),与参考毒株比对序列相似性,并以G基因序列构建系统发生树,分析其遗传演化关系。结果显示:HN1/2012株基因组全长为14 899nt,包含前导序列(50nt)、N基因(1 328nt)、P基因(858nt)、M基因(691nt)、G基因(1 896nt)、GNS基因(1 785nt)、α1α2基因(638nt)、β基因(459nt)、γ基因(400nt)、L基因(6 470nt)和尾随序列(70nt)。病毒9个基因分别由26、43、47、53、37、39、30、-21nt的基因间隔区(IGR)连接。在全基因组水平,HN1/2012株与我国2002年浙江分离株JT02L的相似性最高,但G基因与同期分离株LYC11、LS11相似性最高。重组分析表明HN1/2012株未发生基因重组。HN1/2012株的演化可能与免疫选择压力导致的基因突变有关。本研究测定了HN1/2012株的基因组序列,为我国BEFV分离株的全基因组分子演化研究奠定了基础。

摘要：采用LUXTM荧光PCR技术原理,以牛流行热病毒(BEFV)糖蛋白抗原G基因保守序列为模板设计特异荧光PCR扩增引物,建立BEFV LUXTM实时荧光RT-PCR快速检测方法。试验结果显示,所建立的荧光RT-PCR可特异检测牛流行热病毒RNA,而对蓝舌病病毒、牛病毒性腹泻-粘膜病病毒、水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛白血病病毒以及与BEFV同种属的狂犬病病毒核酸检测呈阴性反应。敏感性试验表明LUXTM荧光RT-PCR对BEFV RNA的检测敏感性比常规RT-PCR方法提高达100倍以上。该LUXTM荧光RT-PCR的批内检测变异系数0.64%-1.17%,批间检测变异系数均小于2%,表明检测体系稳定、重复性好。通过人工添加灭活病毒液的方法制备30份模拟感染牛血清样品,采用上述所建立的BEFV LUXTM荧光RT-PCR方法检测均呈阳性。

摘要：为探索可用来开发牛流行热病毒（bovine ephemeral fever virus,BEFV）疫苗和诊断试剂的候选基因,本研究针对BEFV糖蛋白（G）基因设计了2对特异性引物,用PCR方法扩增基因片段,PCR产物经XhoⅠ和NdeⅠ双酶切后亚克隆到表达载体pET-30上,将鉴定正确的重组质粒（480-pET-30、1107-pET-30）转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,培养阳性菌株D600nm值为0.6-1.0,37℃下用1.0mmol/L IPTG诱导表达目的蛋白,将其纯化之后进行SDS-PAGE和Western blotting免疫原性分析。同时,应用间接ELISA、动物免疫试验及交叉反应试验对目的蛋白进行分析。结果表明,首次发现的1 107bp基因片段是分段表达的,具有很好的生物活性和特异性,更适合作为开发疫苗和诊断试剂的候选基因,为今后建立BEFV的血清学诊断方法及疫苗研发提供了理论基础。

摘要：根据NCBI上公布的牛流行热病毒G基因序列设计、合成了一对检测牛流行热病毒G基因的RT-PCR引物,以牛流行热疫苗为模板,建立了牛流行热的RT-PCR检测方法,经扩增得到大小799bp的片段。该方法具有良好的特异性、敏感性,能扩增出含量为9.576pg的BEFV RNA。从17份疑似牛流行热病毒感染的牛全血中检测出阳性病例5份,经测序后证明为牛流行热病毒G基因片段。结果表明,建立的一步法RT-PCR方法简便易行,可用于牛流行热的分离鉴定、临床病料的检测和分子流行病学调查。

摘要：为建立牛流行热病毒(BEFV)的荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中已登录的BEFV的G基因保守序列设计了1对特异性引物。结果显示,建立的标准曲线线性关系较好,其相关系数为0.996 3。该方法仅对BEFV检测为阳性,表明其特异性强。该方法的检测下限约为4.0×10^1 copies/μL,比普通PCR敏感性高10倍。重复性试验结果显示,该方法的组内和组间变异系数均小于0.76%。利用本方法分别对45份牛病料样品进行检测,结果检出了11份阳性样品,表明所建立的荧光定量PCR方法准确可靠,可以用于BEFV的快速诊断和定量分析。

摘要：通过对牛流行热病毒(bovine ephemeral fever virus,BEFV)中G片段保守区的分析,运用SnapGene设计探针、引物,并优化反应条件。运用最适条件对该方法的敏感性、特异性及重复性进行试验,并检测临床采集的样品。结果显示,本方法特异性较好,其对牛蓝舌病病毒、牛赤羽病病毒进行检测的结果为阴性。该方法线性关系较好,在105~10^10拷贝/μL相关系数达到0.998。该方法较为灵敏,可检测到10拷贝/μL。批内和批间分别重复3次试验得到的变异系数平均值结果较低(<3%)。使用该方法对广东省兽医临床重大疾病综合防控重点实验室收集的109份牛抗凝血样品进行检测,阳性率为7%。本试验成功建立牛流行热病毒TaqMan实时定量PCR检测方法,并将该方法初步运用于牛流行热病毒的临床检测,为BEFV在临床上的快速检测提供更好的方法。

摘要：为了解牛流行热病毒(BEFV)山东流行株G基因的特点,从临床病料中获得山东流行株牛流行热病毒的G基因,并对其进行序列测定和分析。参考GenBank中牛流行热病毒的G基因序列,设计并合成一对特异性扩增G基因引物进行PCR,扩增目的片段,并克隆于pEASY-T3载体上,筛选阳性重组质粒进行序列测定,用MEGA软件、NJ法构建进化树。结果显示,该流行毒株G基因与GenBank中其他BEFV株G基因的核苷酸推导氨基酸的同源性均大于96%;遗传进化关系分析结果表明,BEFV山东流行株与中国台湾流行株具有较高同源性和较近的亲缘关系。

摘要：[目的]分析广东省牛流行热病毒(Bovine ephemeral fever virus,BEFV)分离株JM 2020与其他地区毒株的进化关系,阐明遗传进化与全基因组的特征,为中国乃至世界对牛流行热疾病的流行情况以及预防该疾病提供有用信息。[方法]根据从GenBank下载的BEFV毒株的全基因组序列信息,设计引物PCR扩增糖蛋白(Glycoprotein,G)基因;另设计10对引物用于扩增全基因组,送测序得到10个片段的基因序列,运用DNAStar软件中的EditSeq手动编辑和拼接获得全基因组序列。运用MEGA 6.0分别构建G基因和全基因组进化树进行进化分析。[结果]JM 2020毒株的G基因和全基因组与泰国毒株的核苷酸序列相似性均最高,分别为94.9%~99.3%和99.0%,进化分析表明JM 2020与2013—2017年泰国毒株处于同一小分支,而与JB76H、JT02L等国内毒株有一定进化距离。全基因组测序结果表明,JM 2020全基因组长度为14 902个核苷酸(nt),包括50 nt的前导序列,1 296 nt的核蛋白(Nucleoprotein,N)基因,837 nt的磷蛋白(Phosphoprotein,P)基因,672nt的基质蛋白(Matrixprotein,M)基因,1 872 nt的G基因,1 812 nt的非结构糖蛋白II (Non-structural glycoprotein II,GNS)基因,618 nt的α1、α2基因,444 nt的β基因,345 nt的γ基因,444 nt的RNA依赖性聚合酶(Large multi-functional enzyme,L)基因和73 nt的尾随序列,且分别被21、47、68、67、23、64、59、79和35nt的区域隔开。JM 2020、qy2017及泰国毒株均出现P′基因(P基因多顺反子产物)截断的特征。[结论]JM2020毒株与2017年分离毒株qy2017序列相似性高且均与泰国毒株进化关系较近,与JB76H等我国其他地区毒株有一定进化距离。该研究丰富了中国BEFV流行株的基因组信息,为牛流行热疫病综合防控及开发新疫苗奠定了基础。

摘要：鉴于牛流行热(Bovine Ephemeral Fever,BEF)对养牛行业的危害以及荧光定量PCR技术高效、快速、精准的优点,本研究针对牛流行热病毒(Bovine Ephemeral Fever Virus,BEFV)G基因建立荧光定量PCR检测方法。并用所建立的荧光定量PCR检测方法对临床采集的样本进行检测。结果显示:在GenBank数据库中对BEFV全基因组序列进行比对分析,找出保守序列,设计1对扩增BEFV G基因片段的引物,通过分子克隆构建重组质粒制备标准曲线,扩增效率是95.1%,用所建立的方法检测临床样本,阳性15份,阳性率为75%。该试验成功建立了检测BEFV的荧光定量PCR检测方法,证明云南省的牛场中广泛存在BEFV,建立的荧光定量PCR检测方法对BEFV的临床诊断和流行病学调查等具有应用价值。