摘要：用PCR方法从感染牛疱疹病毒ⅰ型Bartha Nu/67株的MDBK细胞中扩增gD基因,将之克隆到pGEM-T Easy载体。根据对gD基因的结构分析,设计合成3对引物,以获得的克隆质粒为模板,PCR扩增gD胞外域基因,将之分别亚克隆到pGEX-4T-2和pET-32a表达载体中构建成表达质粒pGEX-4T-gDQ、pGEX-4T-gDQB、pGEX-4T-gDHB和pET-gDQ、pET-gDQB、pET-gDHB,利用上述质粒分别转化大肠杆菌BL21和BL21(DE3),IPTG诱导后SDS-PAGE检测,结果pGEX-4T-gDQ、pGEX-4T-gDQB、pGEX-4T-gDHB和pET-gDQ四个表达质粒出现表达且符合预期大小,Western blot表明表达产物均有抗原性。

摘要：为研究牛胚胎气管（EBTr）细胞Toll样受体2（TLR2）在牛疱疹病毒ⅰ型（BHV-1）感染的天然免疫反应中的作用,本研究利用小分子干扰RNA（si RNA）技术,以TLR2为靶向设计并合成了3条si RNA干扰序列,用SYBR GreenⅠ定量PCR方法筛选出最佳的si RNA-TLR2干扰片段,继而转染EBTr细胞使其TLR2沉默后感染BHV-1,用Taq Man定量PCR方法检测BHV-1不同时间点的增殖变化。结果显示,与对照组相比转染后第48小时si TLR2A、si TLR2B和si TLR2C在EBTr细胞中分别对TLR2 m RNA表达量下调了35.05%、69.20%和84.85%,筛选出的si TLR2C片段在第12~72小时可以显著抑制TLR2 m RNA的表达（P〈0.05）,用该片段转染EBTr细胞再感染BHV-1后第6~72小时,si RNA-TLR2组BHV-1 DNA拷贝数显著低于对照组BHV-1 DNA拷贝数（P〈0.05）。本试验成功筛选出了特异性抑制EBTr细胞TLR2基因的si RNA片段,并证明抑制TLR2的表达可降低BHV-1的增殖能力。

摘要：目的建立牛疱疹病毒ⅰ型(BHV-1)PCR检测方法,用于临床牛样本中BHV-1的检测。方法根据已发表的BHV-1 gB基因保守区域设计合成引物,建立BHV-1 PCR方法,对方法的特异性、敏感性、稳定性等进行方法学评价,并用建立的PCR方法检测64份牛临床样本。结果建立的BHV-1 PCR检测方法与牛副流感病毒Ⅲ型(BPIV3)、猪伪狂犬病毒(PRV)、单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)、犬疱疹病毒(CHV)、均无交叉反应;可检测病毒最小滴度为5lg TCID50/mL,对应的DNA模板浓度为5.26×10~2拷贝/μL;BHV-1 DNA在-30℃冰箱放置12个月仍可检测出目的条带。应用建立的方法检测145份牛源组织样本,BHV-1核酸阳性率为15.2%。结论建立的BHV-1PCR检测方法具有快速、特异、敏感及稳定的特点,适合于临床牛样本BHV-1的感染的检测。

摘要：目的 建立牛疱疹病毒ⅰ型(BHV-1)实时荧光定量PCR检测方法,用于牛源性样本中BHV-1的快速检测。方法 根据已发表的BHV-1 g B基因设计特异引物和Taq Man探针,建立BHV-1实时荧光定量PCR方法。并对方法的特异性、敏感性、重复性稳定性等进行测定。用建立的方法对181份牛源性样本进行检测。结果 建立的BHV-1荧光定量PCR检测方法与牛副流感病毒Ⅲ型(BPIV3)、牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)、猫疱疹病毒1型(FHV-1)均无交叉反应;检测灵敏度可达到1×101copies/μL;批内变异系数均小于5%。应用建立的方法检测181份牛源性样本,有6份样本BHV-1核酸为阳性。结论 建立的BHV-1荧光定量PCR检测方法具有快速、特异、敏感及稳定的特点,可用于牛源性样本中BHV-1污染的检测。

摘要：为研究牛疱疹病毒ⅰ型(BHV-1)在牛胚气管细胞(EBTr)中的生长特性和增殖规律,参考文献设计合成特异性引物和探针,建立了TaqMan实时荧光定量PCR方法,检测BHV-1感染EBTr细胞6、12、24、48、72、96、120、144h后病毒的增殖规律,并观察对应时间点的细胞病变(CPE)。结果显示,用100TCID_(50)的BHV-1感染EBTr细胞,48h后开始出现细胞病变,72h细胞病变明显,120h细胞大部分变圆,开始脱落,144h细胞大面积脱落、崩解。实时荧光定量PCR检测结果表明,BHV-1感染EBTr在6h^24h内,病毒缓慢增殖,48h^96h,病毒增殖速度加快,拷贝数呈对数增长,120h^144h,BHV-1的含量仍然呈现升高的趋势,但增长速度变慢。结果证明,BHV-1能够在EBTr中产生CPE,而且CPE程度与病毒DNA增殖规律一致,该结果可以为深入研究BHV-1对EBTr细胞的致病机理提供基础资料。