摘要：本研究针对牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)高度保守的gC基因设计单标记并具有自身荧光淬灭功能的LUX^(TM)引物,建立LUX^(TM)新型实时荧光PCR方法用于快速检测IBRV。该方法对四株IBRV细胞培养物的检测均呈典型阳性反应,而对其它动物疱疹病毒以及健康牛组织DNA和细胞对照的检测结果为阴性,检测时间包括核酸提取仅需1h～2h。试验表明,LUX^(TM)荧光PCR法对IBRV细胞增殖病毒液的检测敏感性可达0.04 TCID_(50),比病毒分离敏感性至少提高10倍;对10倍系列稀释的纯化IBRV核酸样品,LUX^(TM)荧光PCR的检测敏感性比常规PCR可提高10~3倍。将病毒液添加到健康牛精液和血液样品中,该荧光PCR可检测到牛冻存精液中40 TCID_(50)、牛抗凝全血、血清和临床精液中0.04 TCID_(50)的病毒,说明对临床样品的检测有效。本研究所建立的LUX^(TM)荧光PCR方法快速敏感,适合应用于活牛及其遗传物质的进出口检疫、养牛业疾病防控等领域对IBRV的快速检测。

摘要：为了建立有效鉴别牛传染性鼻气管炎病毒（BoHV-1）gg-／tk-基因缺失疫苗人工免疫和BoHV-1野毒株自然感染的鉴别诊断方法，以BoHV-1gG蛋白为抗原建立了间接ELISA（iELISA）抗体检测方法。根据编码BoHV1gG蛋白的基因序列设计特异性扩增引物，以BoHV1基因组DNA为模板扩增gg基因截短片段，克隆至原核表达载体pGEX-6p-1并进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Westernblot分析表明，gg基因在大肠杆菌BL21（DE3）中呈可溶性及包涵体2种形式表达，纯化的gG蛋白具有良好的反应原性。将可溶性gG蛋白纯化后作为包被抗原，建立了BoHV-1gGiELISA抗体检测方法，并优化了各反应条件。使用该方法与商业化试剂盒BoHV-1gE和gB阻断ELIsA进行比较检测，并与其他5种牛常见病原体的阳性血清进行交叉反应检测，同时进行了该方法的重复性试验、保存期试验及消长规律试验；最后使用该方法对临床1031份牛血清进行了检测，血清流行率为83．71%,4（95%CI：81．30％～85．90％）。结果显示，该方法的阴、阳性血清检测的临界值（S／P值）为0．398，与进口试剂盒比较显示该方法具有良好的诊断敏感性和特异性，且本试剂盒可在1：50倍样本稀释下进行检测，而商业化试剂盒是1：1倍样本稀释检测。此外，该方法分析特异性良好，与其他非相关病原体的阳性血清无交叉反应；检测重复性良好；在4℃条件下可保存6个月。该方法在人工感染BoHV～1野毒株和人工免疫BoHv-1gg-／tk-疫苗株20d后可以明显区分疫苗株免疫和野毒株感染。综上所述，本研究成功建立了BoHV-1 gG iELISA抗体检测方法，敏感性和特异性良好，既可以用于有效鉴别疫苗免疫和自然感染，也可作为BoHV-1的血清学诊断方法。

摘要：建立一种PCR技术,既能快速检测疱疹病毒1型成员牛传染性鼻气管炎病毒(bovine infectious rhinotracheitisvirus,IBRV),又能区分牛疱疹病毒5型和伪狂犬病毒。根据基因库中牛传染性鼻气管炎病毒的gD基因序列,应用primer 5.0软件设计了gD PCR引物,建立PCR方法,反应条件是:94℃预变性5min,94℃1min,58℃1min,72℃1min,30个循环,72℃7min,4℃5min。该方法能从IBRV阳性样本和参考毒株中扩增出372bp的目的片段,而从同属的牛疱疹病毒5型中扩增出440bp和206bp两条目的片段,从同属的伪狂犬病毒中扩增出303bp的目的片段,但不能从非疱疹病毒属成员猪呼吸与繁殖综合征病毒中扩增出目的条带。该PCR检测IBRV的灵敏度可达1PFU/mL以上。鉴于其灵敏度高、特异性好,可望在牛疱疹病毒感染快速鉴别检测方面发挥重要作用。

摘要：为建立检测牛疱疹病毒(BHV-1)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)单一或混合感染的荧光PCR检测方法,根据BHV-1gB基因、BRSVF基因、BPIV-3 M基因和BVDV 5’UTR基因保守区序列分别设计特异性引物和TaqMan荧光探针,经条件优化,成功建立了BHV-1、BRSV、BPIV-3和BVDV的四重荧光PCR检测方法。该方法对牛布鲁氏菌、猪瘟病毒、小反刍兽疫病毒、羊多杀性巴氏杆菌无特异性扩增;对BHV-1、BPIV-3和BVDV的最低检测量均为8.268 copies/μL,对BRSV的最低检测量为82.680 copies/μL;该方法重复性好,CV值为1%~2%。应用本方法检测采自湖南省内某屠宰场的865份样品,结果BHV-1、BRSV、BPIV-3和BVDV等4种病原均有检出,其阳性率分别为0.58%,0.81%,0.23%和0.81%。本研究建立的多重荧光PCR检测方法可同时对BHV-1、BRSV、BPIV-3和BVDV进行检测,为这4种病原的快速诊断和鉴别提供了技术支撑。