摘要：为了快速、准确地检测牦牛源牛肠道病毒(Bovine enterovirus,BEV),试验根据GenBank中牦牛源BEV-NH2株3D基因序列(登录号为PP746571)设计可用于检测青海牦牛源BEV的实时荧光定量PCR特异性引物,通过构建标准质粒和绘制标准曲线建立牦牛源BEV实时荧光定量PCR检测方法,对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验,并分别应用该方法及普通RT-PCR方法对青海省海北地区6个牦牛繁育基地的286份腹泻牦牛粪便样品进行检测,计算两种方法的符合率。结果表明:建立的牦牛源BEV实时荧光定量PCR检测方法扩增产物的熔解曲线单一,Tm值在85.6~85.8℃之间,无引物二聚体和非特异性扩增;质粒浓度在3×10^(2)~3×10^(8)copies/μL范围内时标准曲线的线性关系良好,Ct值在10.88~29.63之间,回归方程为y=-3.16x+38.01,R^(2)=0.9964;仅可检测到牦牛源BEV-NH2株,检测不到牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)MY01株、牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)MY20株和牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BcoV)QL21株;对牦牛源BEV的最低检测限为3×10^(2)copies/μL;当模板浓度为3×10^(2)copies/μL、3×10^(3)copies/μL和3×10^(7)copies/μL时,Ct值的变异系数分别为1.28%、1.74%和0.15%,均在1.80%以下。286份牦牛粪便样品中,采用建立的实时荧光定量PCR检测方法检出BEV阳性样品182份,阳性率为63.64%;采用普通RT-PCR方法检出BEV阳性样品114份,阳性率为39.86%;两种方法的符合率为76.22%。说明本研究建立的牦牛源BEV实时荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于牦牛腹泻临床样本的BEV检测。

摘要：为建立快速、准确地检测牛肠道病毒(BEV)及对北京周边地区牛群中BEV感染情况进行检测,本研究通过设计合成扩增BEV 5'UTR序列的引物及探针建立了检测BEV的通用型TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测方法并对反应条件进行了优化。该方法对BEV的最小检测量为0.1 TCID50/0.1 mL,敏感性比病毒分离法高10倍。而且该方法对其他牛相关病毒均无交叉反应。用3批试剂对3个稀释度的BEV培养物进行批内和批间重复性试验,其变异系数均小于1.1%,表明该方法具有良好的重复性。采用该方法对北京周边地区牛群采集的852份临床样品进行检测,并与病毒分离方法比较,两种方法检测结果完全一致。因此,本研究所建立的BEVTaqMan RT-PCR检测方法具有快速、准确、特异性强、敏感性高、重复性好的优点,为国内BEV的检测提供了有力的技术支持。本研究首次通过病毒核酸检测证明了我国部分地区的牛群中存在BEV感染。

摘要：目的 建立一种简便快速、特异性和重复性好、灵敏度高的牛肠道病毒(Bovine Enterovirus, BEV)检测方法。方法 根据GenBank公布的BEV基因序列,选取保守区核苷酸序列,利用Pirmer 5.0设计引物,通过PCR扩增目的基因片段,将其连接到pMD18-T载体上构建重组标准品质粒pMD18-T-BEV。构建荧光定量PCR方法,利用软件Quant Studios Design&Analysis Software自动生成标准曲线及溶解曲线。检测其重复性、特异性和灵敏度并与传统PCR方法比较。结果 建立的荧光定量检测方法标准曲线在3.2×10^(1)~3.2×10^(9)拷贝/μL范围内线性关系良好,相关系数为0.997,斜率为-3.387;组间变异系数<3.16%,组内变异系数<1.67%;与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛库布病毒(BKOV)、牛环曲病毒(BTOV)、牛诺如病毒(BNOV)和牛副流感病毒3型(BPIV3)的cDNA样品无交叉反应;最低检测限度为3.2×10^(1)拷贝/μL,是常规PCR检测灵敏度的1 000倍。利用本研究建立的荧光定量检测方法对采集自内蒙古自治区9个盟市的86份牛腹泻样品进行检测,其阳性率为26.74%,远高于传统PCR检测出的阳性率4.56%。结论 本研究成功建立了一种BEV SYBR GreenⅠReal-time PCR方法,该方法具有较高的灵敏度、特异性和可重复性,适用于规模化养殖场牛肠病毒的快速检测。为内蒙古自治区BEV的检测和流行病学调查提供依据。

摘要：为建立同时检测口蹄疫病毒(FMDV)和牛肠道病毒(BEV)的双重RT-PCR方法,本研究根据已发表的FMDV和BEV基因的5'UTR保守区域,分别设计、筛选出一对特异性引物建立了双重RT-PCR方法,并优化了反应体系和条件。采用该方法检测其他几种牛相关病毒结果均为阴性,表明特异性良好。该方法对FMDV的最低检出限为8 TCID50/0.1 mL,对BEV的最低检出限为2 TCID50/0.1 mL,表明其具有良好的敏感性。采用该方法检测了852份临床样品,并与病毒分离方法比较,结果两种方法检测结果完全一致。本研究首次建立了同时检测FMDV和BEV的双重RT-PCR快速检测方法,该方法的建立为FMDV和BEV的检测提供了一种技术手段。

摘要：为了建立一种能够同时、快速鉴别检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛肠道病毒(BEV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCV)的方法,根据BVDV 5'UTR基因、BEV 5'UTR基因、BRV VP6基因、BCV N基因设计引物,建立了能够同时鉴别检测BVDV、BEV、BRV、BCV的四重一步法RT-PCR方法,该方法检测IBRV、BPIV-3、BRSV均为阴性,对BVDV、BEV、BRV、BCV的核酸检测下线分别为3.28、28.2、23.6、25.0 pg,与现有标准或商品化RT-PCR试剂盒的符合率均为100%,批内和批间重复性试验的检测结果均完全一致,检测222份临床样品的BVDV、BEV、BRV、BCV阳性率分别为15.32%、18.02%、6.31%和4.05%。说明四重一步法RT-PCR方法特异性好、灵敏度高、稳定性强,可用于BVDV、BEV、BRV、BCV的临床鉴别诊断、流行病学调查以及疫病防控。

摘要：根椐GenBank中已发表中病毒性腹泻病毒(BVDV)、中冠状病毒(BCoV)和中肠道病毒(BEV)基因的保守序列,设计合成引物,在建立单一病毒RT-PCR检测方法的基础上,继续优化条件,建立上述3种病毒的多重RT-PCR检测方法,并应用建立的检测方法对临床样本进行检测,计算符合率。结果表明,引物浓度分别为BVDV 0.5μL(20μmol/L),BCoV 0.25μL(20μmol/L),BEV 0.25μL(20μmol/L),退火温度为52℃时,可同时扩增BVDV的289bp,BCoV的458bp和BEV的732bp的特异性片段,对牛流行热病毒(BEFV)、牛轮状病毒(BRV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)均无扩增。该方法最低能检出6.4pg的BVDV,1.28pg的BCoV和6.4pg的BEV的等量混合质粒模板。对24份临床腹泻病料进行检测,与单项RT-PCR检测的符合率为100.0%。本研究建立的多重RT-PCR检测方法,具有准确、快速、特异的特点,可用于临床混合感染的同时检测。

摘要：参照GenBank中登录的牛肠道病毒(BEV)全基因组序列,针对其3D基因设计合成了1对特异性引物,提取病毒RNA,逆转录为cDNA,进行PCR扩增,经条件优化,建立了BEV的RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性进行验证。结果显示,该方法从分离的牛肠道病毒中扩增出了732 bp的特异性目的片段;且对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)等相关病毒均无交叉反应;其检出敏感度达10-1TCID50。应用该方法对山东地区84份临床疑似发病牛样品进行检测,21份为阳性,阳性检出率为25%。