摘要：为了解牛诺如病毒(BNo V)、牛嵴病毒(BKV)和牛环曲病毒(BTo V)在国内的流行情况,本研究参考Gen Bank中登录的BNo V Rd Rp基因、BKV 3D基因和BTo V N基因保守区域,设计3对特异性引物,成功建立了能够同时快速检测BNo V、BKV、BTo V的三重RT-PCR方法。该方法特异性较强,仅对BNo V、BKV、BTo V扩增出特异性条带,对其他5种常见引发犊牛腹泻的病毒均未扩增出条带;敏感性较高,针对p MD18-T-BNo V、p MD18-T-BKV和p MD18-T-BTo V质粒标准品的最低检测限分别为2.73×10^(4)copies/μL、2.87×10^(4)copies/μL、3.18×10^(3)copies/μL;重复性好,同批次样品的3次检测结果均一致。使用该方法对153份临床样品进行检测,结果显示,BNo V、BKV、BToV的阳性率分别为11.11%、25.49%、38.56%,3种病毒混合感染率为7.18%。与其他学者建立的单一RT-PCR检测方法相比,符合率分别为94.77%、93.46%、91.50%。上述结果表明,本试验建立的三重RT-PCR方法为犊牛上述国内新发病毒快速检测及流行病学调查提供了技术支撑。

摘要：为调查牛诺如病毒(BNoV)在新疆不同地区牛场中的感染情况,本实验针对BNoV的RdRp基因设计特异性引物,采用RT-PCR方法对新疆乌鲁木齐、塔城、伊犁、喀什4个地区的7个牛场共230份牛粪便样品进行检测,并获得塔城地区一株BNoV开放阅读框1(ORF1)基因,对其进行遗传进化、同源性及基因重组分析。流行病学调查结果显示,新疆地区BNoV阳性率为17.83%(41/230),其中塔城地区阳性率最高(60.00%,9/15)。对检测的BNoV ORF1基因进行遗传进化分析,结果显示,其属于GIII.2型BNoV,与中国四川地区OK032546.1病毒株相似性最高(94.6%),聚为一支;同源性分析结果显示,本研究中检测到的两株BNoV的ORF1基因序列之间的同源性为100%,均与OK032546.1病毒株相应基因序列同源性最高(96.6%)。ORF1编码的氨基酸序列分析显示两株BNoV ORF1与MZ573179.1病毒株同源性最高(98.35%),且与国内外其他GIII.2型病毒株同源性在76.1%以上。通过对ORF1基因重组分析,结果显示,本研究检测到的BNoV与国内外经典株ORF1基因无基因重组现象。本研究填补了新疆地区对BNoV基因序列研究的空白,为BNoV感染的防制提供了参考依据。

摘要：牛诺如病毒(BNoV)是国内新发的犊牛腹泻病原,笔者拟建立检测BNoV的Real-time PCR方法。根据BNoV流行株的RNA聚合酶(RdRp)基因序列设计引物,通过优化反应条件和体系,成功建立基于EvaGreen检测BNoV的Real-time PCR方法。该检测方法的Ct值与标准品模板在2.24×102~2.24×108拷贝·μL-1线性关系良好,相关系数R2=0.997,扩增效率为98.44%;该方法可特异性检出BNoV,对其他犊牛腹泻相关病原呈阴性;最低检测限为22.4拷贝·μL-1;批间和批内的变异系数均小于2%,重复性好。对2017年9月—2019年5月采自河南省的221份犊牛腹泻样本中BNoV的检出率为11.31%(25/221),采样场阳性率为92.86%(13/14)。本试验所建方法灵敏度高、特异性强、稳定性好,为BNoV的检测和流行病学调查提供了有力手段。

摘要：牛诺如病毒(BNoV)是国内新发的犊牛腹泻的病原,为建立高效快速、特异的BNoV定量检测方法,本研究参照GenBank登录的BNoV的RdRp基因的保守序列,设计合成了1对特异性引物和1条探针,通过优化反应条件和体系,建立了BNoV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,该方法选择的引物具有高度特异性,只对BNoV有特异性扩增,而对牛冠状病毒等4种犊牛腹泻常见病原未见扩增;对BNoV核酸最低检测限为15.9 copies/μL,且批内、批间变异系数均小于2%,重复性好。对采集自2017年9月至2019年11月河南、山东和四川省的261份犊牛腹泻样本进行检测,结果显示BNoV的阳性检出率为11.49%(30/261)。本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法对BNoV的病原检测和流行病学调查具有重要意义。

摘要：为建立能同时检测牛诺如病毒(BNoV)和牛冠状病毒(BCoV)的聚合酶链反应(PCR)检测方法,根据BNoV和BCoV基因组的保守区域设计2对特异性引物,预期特异性扩增BNoV和BCoV的片段大小分别为542 bp和896 bp。特异性检测结果显示,该方法能特异性扩增BNoV和BCoV的目的条带,未扩增出其他犊牛腹泻病毒性病原;BNoV和BCoV的最低检测限分别为6.71×10^4 copies/μL和1.38×10^5 copies/μL。对采集自河南地区的127份犊牛腹泻样品的检测结果显示,BNoV的阳性率为6.30%(8/127),BCoV的阳性率为14.96%(19/127),与单项PCR检测结果相一致。结果表明,建立的双重PCR方法可用于BNoV和BCoV的检测及流行病学调查。

摘要：本研究根据BNoV和BKoV基因组的保守区域设计2对特异性引物,建立了能同时检测牛诺如病毒(Bovine norovirus,BNo V)和牛嵴病毒(Bovine kobuvirus,BKo V)的双重PCR检测方法。该方法能特异性扩增BNo V和BKo V的目的条带,且未扩增出其他犊牛腹泻病毒性病原;BNoV和BKoV的最低检测限分别为5.39×105 copies/μL和2.23×106 copies/μL;对临床采集的127份犊牛腹泻样品检测结果显示,BNoV的阳性率为6.30%(8/127),BKoV的阳性率为4.72%(6/127),两者与单一PCR检测结果相一致,符合率为100%。本研究建立的双重PCR方法具有良好的敏感性、特异性、重复性,可用于BNoV和BKoV的快速检测和流行病学调查。

摘要：为建立能同时检测牛诺如病毒(BNoV)和牛环曲病毒(BToV)的方法,根据BNoV和BToV基因组的保守区域设计2对特异性引物,预期特异性扩增BNoV和BToV的片段大小分别为542,698 bp,建立了BNoV和BToV的双重PCR检测方法。特异性检测结果显示,该方法能特异性扩增BNoV和BToV的目的条带,且未扩增出其他犊牛腹泻病原;对BNoV和BToV的最低检出量分别为1.90×10^4,1.86×10^4拷贝/μL。利用该方法对采自河南部分地区的184份犊牛腹泻样品的检测结果显示,BNoV和BToV的阳性检出率分别为11.41%和12.50%,与单一PCR检测结果一致。结果表明,本试验建立的方法对BNoV和BToV的鉴别诊断、混合感染和流行病学调查具有重要的应用价值。

摘要：为建立能同时检测牛诺如病毒(BNoV)、牛星状病毒(BAstV)和牛环曲病毒(BToV)的方法,根据BNoV、BAstV和BToV基因组的保守区域设计3对特异性引物,预期特异性扩增BNoV、BAstV和BToV的片段大小分别为542,376,698 bp,建立了BNoV、BAstV和BToV的多重PCR检测方法。结果显示,该方法能特异性扩增BNoV、BAstV和BToV的目的条带,且未扩增出其他犊牛腹泻病原;BNoV、BAstV和BToV的最低检测限分别为1.34×10^4,1.06×10^4,1.03×10^4拷贝/μL。对采集自河南省的221份犊牛腹泻样品的检测结果显示,BNoV、BAstV和BToV的检出率分别为9.96%(22/221),18.10%(40/221)和19.00%(42/221)。三者与单一PCR检测结果相一致。结果表明,本试验建立的多重PCR方法可用于BNoV、BAstV和BToV的检测和流行病学调查。

摘要：为建立能同时检测牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)、牛诺如病毒(bovine norovirus,BNoV)和牛嵴病毒(bovine kobuvirus,BKV)的方法,根据BCoV、BNoV和BKV基因组的保守区域设计3对特异性引物,预期特异性扩增BCoV、BNoV和BKV的片段大小分别为896,542,216 bp,建立了BCoV、BNoV和BKV的多重PCR检测方法。特异性检测结果显示,该方法能特异性扩增BCoV、BNoV和BKV的目的条带,且未扩增出其他犊牛腹泻(calf diarrhea,CD)病原;BCoV、BNoV和BKV的最低检测限分别为9.51×10^5,5.39×10^5,2.23×10^6 copies/μL。对采集自河南部分地区的127份CD样品的检测结果显示,BCoV的阳性率为14.96%(19/127),BNoV的阳性率为6.30%(8/127),BKV的阳性率为4.72%(6/127),三者与单一PCR检测结果相一致。结果表明,本研究建立的多重PCR方法可用于BCoV、BNoV和BKV的检测和流行病学调查。

摘要：为建立能同时快速检测牛星状病毒(BAstV)和牛诺如病毒(BNoV)的方法,本研究根据BAstV ORF1a基因和BNoV RdRp基因设计了2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了能够同时检测BAstV和BNoV的双重PCR方法。特异性试验结果显示,该方法对牛轮状病毒等5种犊牛腹泻常见病原的扩增结果均为阴性,仅BAstV和BNoV扩增结果为阳性,特异性较强;敏感性试验结果显示,该方法对BAstV和BNoV重组质粒的最低检测限分别为1.09×10^3拷贝/μL和1.42×10^3拷贝/μL,敏感性较高;批内和批间试验结果一致,该方法重复性好。利用该方法和各病原单一PCR方法同时对221份河南省犊牛腹泻粪便样品进行检测,BAstV和BNoV的阳性检出率分别为18.1%和9.96%,两种方法符合率为100%。本研究在国内首次建立了检测BAstV和BNoV的双重PCR方法,其特异性强,敏感性高,重复性好,为BAstV和BNoV的鉴别检测及其分子流行病学调查提供了技术支持。