摘要：目的为对公共场所空调系统有害微生物进行有效检测与预防,本研究拟建立空调通风系统中重要致病菌——马链球菌(Streptococcus equi)的高效、特异的PCR检测方法。方法基于序列相似性比对方法挖掘物种特异DNA片段,设计扩增引物并优化PCR条件,通过梯度稀释法构建不同浓度DNA模板并检测PCR扩增效果,确定PCR检测灵敏度。结果从马链球菌基因组序列中挖掘到6个特异的DNA区段,长度分别为233、189、74、54、112、196 bp。以189 bp的特异DNA片段为检测靶标设计PCR引物,优化确定最优退火温度为58.4℃,确定该引物能有效区分马链球菌的多个近缘种;当PCR循环数为25、30、35时,20μl PCR扩增体体系最低可检出400 fg(1.27×10^(5)拷贝)、4 fg(1.273×10^(3)拷贝)、0.4 fg(1.27×10^(2)拷贝)的模板DNA。结论本研究建立的马链球菌PCR检测体系具有很好的物种特异性,检测灵敏度远高于多个已报道的马链球菌PCR检测体系,为公共场所空调系统有害微生物马链球菌的防控提供了新的技术选择。

摘要：集中空调内部容易滋生细菌、真菌等微生物,成为有害微生物污染传播和扩散的媒介。为对公共场所空调系统有害微生物酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)进行有效检测与预防,该研究建立该菌的高效、特异的PCR检测方法和重组酶等温扩增(recombinase aided amplification,RAA)结合侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)的快速恒温检测方法。基于序列的相似性比对方法,从酿脓链球菌基因组序列中挖掘到5个特异的DNA区段,长度分别为5348、1098、5287、5369、240 bp。以5369 bp的特异DNA片段为检测靶标,设计PCR引物,优化确定最优退火温度为60.0℃;对PCR引物的特异性进行分析,确定该引物能有效区分酿脓链球菌的多个近缘种;当PCR循环数为25、30、35时,最低可检出400 fg/μL(1.248×105拷贝/μL)、4 fg/μL(1.248×103拷贝/μL)、0.4 fg/μL(1.248×102拷贝/μL)的模板DNA。设计RAA-LFD引物及探针,优化反应体系,确定最优反应温度为37℃;对RAA-LFD引物及探针进行特异性分析,确定该引物能有效区分酿脓链球菌的多个近缘种;当反应时间为5、10、15、20、25 min时,最低可检出400 fg/μL(1.248×105拷贝/μL)、4 fg/μL(1.248×103拷贝/μL)、4×10–1 fg/μL(1.248×102拷贝/μL)、4×10–2 fg/μL(1.248×101拷贝/μL)、4×10–5 fg/μL(1.248×10–2拷贝/μL)。建立的酿脓链球菌的PCR检测体系和RAA-LFD快速检测体系特异性强、灵敏度高、快速高效,为公共场所集中空调系统有害微生物酿脓链球菌的检测、防控提供新的技术选择。