摘要：为了明确河北省内致犊牛感染性腹泻主要病原,本研究自河北省8个地区采集775份犊牛腹泻粪便样品,根据GenBank中登录的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′UTR基因、牛冠状病毒(BCoV)N基因、牛轮状病毒(BRV)VP6基因和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gB基因序列设计特异性引物,参照文献合成隐孢子虫18S rRNA和大肠杆菌16S rRNA引物,利用PCR方法对BVDV、BCoV、BRV、IBRV、隐孢子虫和大肠杆菌进行检测。结果显示,775份犊牛腹泻临床样品中,BVDV的阳性率为27.11%(205/775);BCoV的阳性率为17.52%(137/775);BRV的阳性率为9.85%(77/775);IBRV的阳性率为3.71%(29/775);隐孢子虫的阳性率为12.28%(96/775);大肠杆菌的阳性率为20.46%(160/775);还有9.10%的样品未检测出病原。在河北省部分地区采集的犊牛腹泻粪便样品中,BVDV检测阳性率最高为27.11%,在冬季犊牛BVDV的感染率最高为40.21%,且唐山和张家口地区奶牛场BVDV的感染率高于其他6个地区。本研究明确了河北省内致犊牛腹泻主要病原,为河北省内犊牛腹泻的防制提供了方向。

摘要：旨在确定新疆地区致犊牛腹泻病中埃希氏大肠杆菌的基因型。从采自阿克苏周边的3个奶牛场30份患腹泻的犊牛粪便中分离、纯化、鉴定出34株埃希氏大肠杆菌。根据GenBank公布的大肠杆菌的eaeA基因序列,用Oligo 6.0软件分别设计2对特异性引物,利用聚合酶链式反应,对所分离大肠杆菌eaeA基因进行PCR扩增。结果表明,有4株PCR产物为918bp的目的片段,阳性率为11.8%(4/34)。将阳性样品进行序列分析,结果与已发表的序列同源率为100%。所测序列呈递GenBank数据库,得到序列登陆号为JQ350701、JQ350702、JQ350703和JQ350704。

摘要：牛环曲病毒(BToV)是国内新发现的致牛腹泻的病原。为建立检测BToV的TaqMan荧光定量RT-PCR方法,本研究根据GenBank中BToV的膜蛋白(M基因编码)基因序列设计引物和TaqMan探针,通过反应条件和体系优化,建立了检测BToV的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果显示:该方法在2.34×10^(1)拷贝/μL~2.34×10^(8)·拷贝/μL与Ct值呈良好的线性关系,相关系数R^(2)值为0.9998,扩增效率为98.04%;该方法仅能检测出BToV核酸,而不能检出其他牛常见相关病原核酸;对BToV重组质粒标准品的最低检测限为23.4拷贝/μL;批内变异系数CV为0.25%~1.34%,批间变异系数CV为1.35%~3.41%;该方法对39份临床腹泻犊牛粪便样品的检出率(71.8%)明显高于文献报道的SYBR Green荧光定量RT-PCR(61.5%)和套式RT-PCR(59.0%)。且3种方法之间的阳性符合率均为100%。对2019年11月~2020年12月采自河南、云南和四川的144份肉牛、奶牛、牦牛腹泻粪便样品中BToV的检出率为18.75%(27/144),场阳性率为84.62%(11/13)。综上所述,本研究首次建立了基于BToVM基因的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。所建方法的特异性强、灵敏度高、重复性和稳定性好,为国内BToV的检测和流行病学调查提供了更为精确的方法。

摘要：【目的】建立一种快速、准确且能定量分析牛嵴病毒(Bovine kobuvirus,BKoV)的检测方法。【方法】根据GenBank上发布的牛嵴病毒3D基因序列设计合成一对特异性引物和一条探针,通过优化反应体系建立牛嵴病毒Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法,并对临床样品进行检测。【结果】该方法最佳上下游引物浓度均为300nmol·L^(-1),探针浓度为400 nmol·L^(-1),在1×10^(1)~1×10^(8)copies·μL^(-1)呈现良好的线性关系,线性相关系数R^(2)=0.999,扩增效率为103%;特异性较强,在多个犊牛腹泻相关病原中,只检测出牛嵴病毒;敏感性较高,对BKoV质粒标准品最低检测下限为1×10^(1)copies·μL^(-1),而普通RT-PCR对BKoV质粒标准品最低检测下限为1×10^(2)copies·μL^(-1);重复性较好,组内变异系数和组间变异系数均小于3%。2021年3~5月采自内蒙古地区牧场的37份犊牛粪样中BKoV的检出率为24.3%,通过标准曲线计算其病毒载量,其中腹泻粪样平均病毒载量为3.7×10^(5)copies·μL^(-1),健康犊牛粪样平均病毒载量为8.65×10^(3)copies·μL^(-1)。【结论】建立的牛嵴病毒Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、稳定性好、灵敏度高,为BKoV的检测和分子流行病学调查提供了有力的手段。

摘要：牛纽布病毒(bovine nebovirus,BNeV)是国内近几年发现的引起犊牛腹泻的新病原,为了建立快速、准确且能定量分析BNeV的检测方法,本试验根据GenBank上发布的BNeV聚合酶基因(RdRp)序列设计合成了1对特异性引物和1条探针,并通过优化反应体系,成功建立了BNeV TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法并对临床样品进行检测。结果表示,该方法最佳上下游引物浓度均为500 nmol/L,探针浓度为400 nmol/L,在1×10^(8)~1×10^(1)拷贝/μL之间呈现良好的线性关系,线性相关系数R^(2)=0.996,扩增效率为10^(5).9%;该方法特异性较强,在多个犊牛腹泻相关病原中,只检测出BNeV;敏感性较高,对BNeV质粒标准品最低检测下限为1×10^(1)拷贝/μL,而普通PCR对BNeV质粒标准品最低检测下限为1×10^(3)拷贝/μL;重复性较好,组内变异系数和组间变异系数均小于3%;对2021年3-5月采自内蒙古地区牧场的37份犊牛粪样中BNeV的检出率为35.1%,通过标准曲线计算其病毒载量,其中腹泻粪样平均病毒载量为8.7×10^(5)拷贝/μL。本研究建立的BNeV TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的特异性强、稳定性好、灵敏度高,为BNeV的检测和分子流行病学调查提供了有力的手段。

摘要：牛诺如病毒(BNoV)是国内新发的犊牛腹泻病原,笔者拟建立检测BNoV的Real-time PCR方法。根据BNoV流行株的RNA聚合酶(RdRp)基因序列设计引物,通过优化反应条件和体系,成功建立基于EvaGreen检测BNoV的Real-time PCR方法。该检测方法的Ct值与标准品模板在2.24×102~2.24×108拷贝·μL-1线性关系良好,相关系数R2=0.997,扩增效率为98.44%;该方法可特异性检出BNoV,对其他犊牛腹泻相关病原呈阴性;最低检测限为22.4拷贝·μL-1;批间和批内的变异系数均小于2%,重复性好。对2017年9月—2019年5月采自河南省的221份犊牛腹泻样本中BNoV的检出率为11.31%(25/221),采样场阳性率为92.86%(13/14)。本试验所建方法灵敏度高、特异性强、稳定性好,为BNoV的检测和流行病学调查提供了有力手段。

摘要：纽布病毒(nebovirus, NeV)是国内新发的犊牛腹泻病原,本试验目的是建立检测NeV的real-time RT-PCR方法。根据国内NeV流行株的聚合酶基因(RdRp)序列设计引物,通过反应条件和体系优化,成功建立基于TB Green检测NeV的real-time RT-PCR方法。结果显示:该方法在2.9×10~1～2.9×10~9copies·μL^(-1)之间呈现良好的线性关系,线性相关系数R^2=0.999 4,扩增效率为98%;该方法只特异性检出NeV,不检出常见无关病原;最低检测下限为29 copies·μL^(-1);批内和批间的变异系数分别为0.89%～1.89%和0.83%～1.15%;该方法对临床样本的检出率高于文献报道的三种检测方法(P<0.05)。对2018年8—11月采自新疆和辽宁的135份奶犊牛腹泻样本中NeV的检出率为67.41%,场阳性率为100%(15/15)。所建方法的特异性和稳定性好、灵敏度高,为NeV的检测和流行病学调查提供了有力的手段。

摘要：为建立特异灵敏的检测牛冠状病毒(BCoV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法,并对犊牛腹泻粪便样品进行检测。本实验根据牛冠状病毒(BCoV)聚合酶基因nsp10核苷酸序列分别设计了1对引物和探针,通过反应体系和条件的优化,建立了检测BCoV的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法在3.36×10^1拷贝/μL^3.36×10^9拷贝/μL,质粒标准品与Ct值呈现良好的线性关系,相关系数R^2=0.9996,扩增效率E=109%;该方法只特异性检出BCoV,而不能检出其它常见腹泻病原,特异性较强;对质粒标准品的检测下限为33.6拷贝/μL,与所比较方法的敏感性数量级相同,敏感性较高;批内与批间重复性试验的变异系数均小于5%,重复性较好。该方法对腹泻粪便样品中BCoV检出率高于国外文献报道的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。利用该方法对采集自新疆和辽宁的16个养殖场153份犊牛腹泻粪便样品进行了BCoV的检测,BCoV阳性率为71.24%,场阳性率为100%,表明犊牛感染BCoV的现象普遍。本实验首次建立了靶向BCoV聚合酶基因的荧光定量RT-PCR检测方法,其特异性和稳定性好,灵敏度较高,为BCoV的快速检测和流行病学调查提供了有力的手段。

摘要：牛嵴病毒(BKoV)可能是与犊牛腹泻相关的潜在病原,为建立快速检测BKoV的方法,本研究根据BKoV 3D基因的保守序列,设计特异性引物对,通过优化反应条件和体系,建立了基于EvaGreen染料检测BKoV的实时定量PCR方法。该方法Ct值与模板在1.08×10^(2)~1.08×10^(8) copies/μL范围内线性关系良好,扩增效率为106.4%;该方法仅检测BKoV时结果呈阳性,检测其他犊牛腹泻相关病原时结果呈阴性;能检出BKoV的最低检出限为10.8 copies/μL;批内和批间的变异系数均小于2%,重复性好。用该方法对311份采自河南、山东和四川省的犊牛腹泻样本进行检测,河南省BKoV的检出率为7.38%(20/271),其他两省的样本均未检测出BKoV。本研究建立的方法灵敏度高、特异性强、稳定性好,为BKoV的检测和流行病学调查提供了有力手段。

摘要：为建立能同时快速检测牛星状病毒(bovine astrovirus,BAstV)和牛环曲病毒(bovine torovirus,BToV)的方法,本研究根据BAstV的ORF1a和BToV的S基因的保守区域分别设计了2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了能够同时检测BAstV和BToV的双重RT-PCR方法。特异性结果显示,该方法与牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRo V)、牛诺如病毒(bovine norovirus,BNoV)、牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)和牛嵴病毒(bovine kobuvirus,BKoV)无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对BAstV和BToV质粒标准品的最低检出下限分别为1.12×10~4copies/μL和1.0×10~3copies/μL。应用该方法和各病原RT-PCR方法同时对221份河南省犊牛腹泻粪便样品进行检测,结果显示BAstV的阳性率为18.1%,BToV的阳性率为19%,其中BAstV和BToV共感染的阳性率为6.79%,双重RT-PCR方法和各病原RT-PCR方法的符合率为100%。结果表明,本研究建立的双重RT-PCR方法可用于BAstV和BToV的病原监测及流行病学调查。