摘要：根据GenBank中犬细小病毒(CPV)和犬冠状病毒(CCV)基因序列各设计了一对引物,经试验条件的优化,建立了检测CPV的PCR方法和CCV的RT-PCR方法,扩增目的片段大小分别为337bp和852bp。在此基础上建立了检测CPV和CCV双重PCR方法。该双重PCR方法能特异的扩增CPV和CCV,且分别扩增出1.08ng和3.2ng总核酸量。通过检测96份临床样品,对双重PCR方法和胶体金试纸条方法进行了对比试验。结果表明,建立的双重PCR方法快速、敏感、特异性高,可以用于CPV和CCV鉴别检测。

摘要：参考Gen Bank上登录的犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）和犬冠状病毒（CCV）的基因序列保守片段分别设计特异性引物,建立了可以同时检测CDV（684 bp）、CPV（213 bp）和CCV（417 bp）的三重PCR方法。特异性结果表明,所建立的体系只能扩增CDV、CPV、CCV,而不能扩增犬腺病毒Ⅱ型（CAV-Ⅱ）和犬副流感病毒（CPIV）;敏感性试验表明,该方法对CDV、CPV和CCV的最低核酸检测量分别为1.39×10^- 2、6.0×10^-2和6.7×10^-2 copies/L,其敏感性比普通PCR高100倍。采用建立的三重PCR方法对北京、山东地区收集的临床粪便样品进行检测结果表明,使用三重PCR体系的扩增结果与单项PCR扩增结果一致,符合率为100%。以上结果表明该方法快速、敏感、特异性强,对上述3种病毒能够进行快速鉴定诊断,为临床诊断提供了快速简便的方法。

摘要：为建立鉴别检测犬瘟热病毒(CDV)和犬冠状病毒(CCoV)的方法,本研究采用PCR方法分别扩增CDV N基因和CCoV S基因,并克隆至pMD18-T载体中构建重组质粒pCDV-N、pCCoV-S,均经PCR和测序鉴定后测定浓度作为质粒标准品。同时针对CDV N基因和CCoV S基因设计特异性引物和TaqMan探针,采用方阵试验对各反应条件的优化,建立了同时检测这两种病毒的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。利用10倍倍比稀释的质粒标准品按照该方法检测,建立标准曲线,结果显示,两个重组质粒标准品均与各自的Ct值具有良好的线性关系。采用该方法分别检测CDV、CCoV、犬细小病毒、犬传染性喉气管炎病毒2型、犬副流感病毒,评估该方法的特异性;将两种质粒标准品分别10倍倍比稀释并等体积混合后,取108~101稀释度的质粒混合物作为模板,采用该方法检测,评估该方法的敏感性;将两种质粒标准品10倍倍比稀释并等体积混合后,分别取107、105、103稀释度的质粒标准品混合物采用该方法检测,评估该方法的重复性。结果显示,该方法仅能特异性扩增CDV和CCoV,与犬的其他病毒均无交叉反应,特异性较强;对CDV质粒标准品的检测限为5.0×103拷贝/μL,对CCoV质粒标准品的检测限为4.93×103拷贝/μL,敏感性较高;组内和组间的变异系数均小于3%,重复性较好。利用本实验建立的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法和已报道的CCoV RT-PCR及国标规定的CDV RT-PCR方法同时检测采集的100份临床腹泻犬样品,结果显示,共检出35份阳性样品,其中,CDV的阳性检出率为16%(16/100),CCoV的阳性检出率为19%(19/100),阴性样品65份,与CCoV和CDV参考方法的检测结果均一致。本研究建立的CDV和CCoV双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法可在40 min内完成检测,且准确、快速、敏感,为CDV和CCoV临床大量样品的快速和特异性鉴别检测提供了有效技术手段。

摘要：根据 Gen Bank中 Wesseling发表的犬冠状病毒 K378株纤突蛋白基因序列 ,设计合成了能扩增 372 bp基因片段的套式引物。用异硫氰酸胍—酚—仿一步抽取法提取细胞总 RNA进行反转录 ,再以此产物进行套式 PCR扩增 ,并筛选出最佳套式 PCR扩增条件。结果经套式 PCR扩增能得到与设计大小相同的产物 ,并且不扩增犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬 型腺病毒、狂犬病病毒的核酸。敏感性试验表明 ,此法能扩增出犬冠状病毒强毒细胞培养物 (毒价为 1 0 -4.2 TCID5 0 / 0 .1 ml) 1 0 -6稀释的反转录产物 ,远高于常规 RT PCR。经初步应用表明 。

摘要：近年来犬细小病毒病和犬冠状病毒病门诊量升高,2种病毒感染后临床症状相似,且存在混合感染、难以区别。本试验根据GenBank已发表的序列,应用Primer 5.0软件对CPV-2、CCV保守区设计引物,采用不同条件进行PCR反应,验证引物特异性,确定反应条件,建立了检测CPV和CCV的双重PCR检测方法。采用该方法对部分诊所收集的140份CPV和CCV疑似病例的病料进行病原学检测,将双重PCR检测结果与单个PCR检测和胶体金试纸检测结果进行对比。结果表明,该方法敏感性高于胶体金试纸,特异性高,双重PCR检测结果与单个PCR检测结果一致,可用于CPV和CCV的病原检测。

摘要：用CDV、CCV特异性引物对同一样品中CDV和CCVRNA模板进行联合RT PCR扩增 ,并对扩增条件进行了优化。结果同时得到了两条大小与试验设计完全相符的特异性扩增带 ,且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒、轮状病毒的核酸。敏感性试验表明 ,该联合PCR能检测出 10 - 4倍稀释的CDV模板 (10 6 6 TCID50 / 0 1mL)和 10 - 3倍稀释的CCV模板 (10 5 9TCID50 /0 1mL)。通过对 7份临床发病犬病料的检测 ,其阳性检出率高于电镜负染检查。初步应用表明 ,此法具有高度敏感、特异、准确、快速等特点 ,适用于兽医临床对CDV。

摘要：利用A72细胞(犬纤维肉瘤细胞系)从上海市某宠物医院临床表现为急性胃肠炎症状的幼犬腹泻粪便中分离到1株病毒,通过噬斑纯化、病毒理化特性检测以及动物回归实验和RT-PCR鉴定,证明所分离到的病毒为犬冠状病毒(Canine coronavirus,CCV),将其命名为CCV-SHdc株。根据Gen Bank公布的CCV S基因序列,设计合成4对特异性引物,利用RT-PCR成功扩增获得CCV-SHdc株S基因序列,同时进行序列测定和核苷酸系统发育进化树绘制。结果显示,CCV-SHdc株的S基因序列全长4 364 bp;该毒株与日本分离的CCV 5821株亲缘关系最近,处于同一分支,与意大利分离的CCV 23/03和CCV Elmo/02株亲缘关系较远。核苷酸与氨基酸同源性分析表明,CCV-SHdc株与CCV 23/03和CCV Elmo/02株可能属于不同基因型,已有很多点发生突变,这种突变的累积有可能引起病毒毒力的变化。

摘要：本研究根据Wesseling（1992）发表的K378株犬冠状病毒（CCV）纤突蛋白（S）基因序列,设计合成了2对寡聚核苷酸引物P1（18 bp,1520～1537 bp）、P2（19 bp,2072～2090 bp）和P3（20 bp,2621～2640 bp）、P4（20 bp,2944～2963 bp）。采用异硫氰酸胍法分别从美国参考株CCV NL-18和两个国内分离株CCV YS1、CCV CI1接种的CRFK细胞培养物中提取细胞总RNA,逆转录合成cDNA第一链后,

摘要：塔里木农垦大学乔军、解放军大学夏咸柱、东北农业大学何宠彬等对此课题进行了研究。他们利用犬瘟热(CDV)和犬冠状病毒(CCV)牧异性引物对同一样品中CDV和CCV的RNA模板进行联合RT—PCR扩增，并优化其扩增条件，得到两条大小与试验设计完全相符的特异性扩增带，且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒、轮状病毒的核酸。其敏感性试验表明：该联合PCR能检测出10^-4倍稀释的CDV模板(10^6.6TCID50／0．1mL)。对7份临床发病犬病科检测，其阳性检出率可高于电镜负染检查。这表明此法有高度敏感、特异、准确、快速等特点，适用于当前民用和军用兽医临床对CDV、CCV的检测和对犬的其他疾病的鉴别诊断。

摘要：根据犬冠状病毒(caninecoronavirus, CCV) 的S基因序列, 用计算机设计并合成了1对引物P1、P2, 以此引物及以从美国进口的CCV疫苗的反转录产物为模板, 初步建立了检测CCV的RT PCR。将纯化的PCR产物成功地克隆到pGEM T easy载体中, 鉴定、测序并进行同源性分析。结果表明, 与1 71和UCD 1株同源性分别为91 5%和94 3%。该RT PCR能对疫苗中CCV及CCV参考株USCV B1的S基因进行特异性地扩增,长度为575bp, 对犬的其他病毒及CRFK细胞未能扩增出任何片段, 该RT PCR能检测出0 5μLCCV培养液/2g粪便。用建立的RT PCR在上海对50条犬粪便进行检测, 结果表明CCV阳性6例。本研究建立了检测犬粪便中的CCV的RT PCR, 能用于犬冠状病毒流行病学调查。