摘要：目的建立检测狂犬病毒(RV)核蛋白(N)基因片段的TaqMan PCR检测方法。方法针对RV N基因保守区域设计特异性引物与探针;优化检测体系中引物与探针的浓度;以体外转录的RV完整的N基因RNA作为定量分析模型;考核检测体系灵敏性、特异性、稳定性;初步用于RV的检测。结果引物和探针具有良好的特异性,使用浓度分别为0．6μmol/L和0．2μmol／L,可检测到2700个RNA拷贝数,较传统RT-PCR检测方法敏感性提高了10倍;同一样品Ct值重复检测5次,变异系数均<5％,表明检测体系具有较好的稳定性;通过所建立的检测体系,绘制了以模板拷贝数为分析指标的RV定量检测标准曲线,对实验室内保存毒株的检测结果显示TaqMan PCR检测比普通PCR检测更快捷、敏感。结论所建立的RV TaqMan PCR可以用于RV的实验室检测,并且比普通PCR检测方法更灵敏、特异。

摘要：目的建立狂犬病毒血清中和抗体效价的快速检测方法,以实现狂犬疫苗免疫效果的定量评价,指导高危人群及动物种群的免疫预防。方法采用常规方法建立杂交瘤细胞株并制备抗狂犬病毒核蛋白单抗,以亲和层析法进行纯化,异硫氰酸荧光黄标记制备荧光抗体;以BHK-21细胞系培养狂犬病毒细胞适应株CVS-11,以染毒细胞测定荧光抗体的工作浓度后,通过荧光抗体染色法测定CVS-11细胞半数感染量(TCID50);利用狂犬病毒灭活疫苗免疫犬制备抗狂犬病毒血清,并以国际兽疫局标准品进行标定;参考世界卫生组织及国际兽疫局推荐方法,确定中和试验程序,对51份样品血清进行测定,并与国际狂犬病参考实验室的检测结果进行比较,评价其精确及可靠程度。以Kaber法公式和MicrosoftExcel软件为基础,设计被测样品中和效价计算方法。结果制备的抗狂犬病毒核蛋白单抗的亚型为IgG2a;纯化、标记后的荧光抗体工作浓度为1∶400;CVS-11株的使用量为每孔100TCID50;本研究建立的检测程序对51份人及犬血清测得的中和效价结果与国际参考实验室的测定结果一致;自行设计的计算方法操作简便,计算快捷。结论成功建立了与国际标准相当的狂犬病毒中和抗体效价测定和计算方法。

摘要：目的:克隆狂犬病毒ERA株核蛋白基因并对核蛋白主要抗原表位进行分析。方法:根据GenBank中已发表的RVN基因序列,设计合成了1对特异性引物,对RVERA株N基因进行了RT-PCR扩增。将PCR产物纯化后与pMD18-T连接得到重组质粒pMD-N,并进行核苷酸序列测定。结果:该基因全长1353bp,编码450个氨基酸。RVERA株与Gen-Bank中RV不同固定毒株和分离毒株N基因相比,核苷酸的同源性为98.0%～99.6%,推导的氨基酸序列的同源性为98.3%～99.6%。核蛋白主要抗原表位分析表明,ERA株与其他固定毒株和分离毒株相比,仅在BC抗原表位(369～383位氨基酸)和Th抗原表位(394～408位氨基酸)处有1～3个氨基酸的不同,其他表位无差异。但与Lagosbat、Mokola和Duvenhage毒株相比,抗原位点氨基酸组成差异明显。结论:RVERA株N基因可用于基因工程疫苗研制和核酸检测的靶基因;核蛋白可作为抗原用于狂犬病的检测。

摘要：以人源抗狂犬病毒糖蛋白母本单链抗体ScFv为模板,利用PCR点突变分别在重链FR可变区VH(44)和轻链FR可变区VL(100)分别引入一个半胱氨酸,成功构建了重组单链二硫键稳定抗体基因。连接pET22b(+)载体,转化入*** BL21(DE3)得到工程菌,IPTG诱导表达。体外复性并经Ni-NTA亲和层析对目的蛋白ScdsFv进行纯化;利用荧光抗体实验和ELISA检测抗体活性及稳定性。结果表明重组ScdsFv蛋白实现了原核高效表达,通过体外复性和Ni-NTA柱纯化获得纯度大于90%的ScdsFv蛋白。荧光抗体实验和ELISA结果表明ScdsFv具有特异的抗原结合活性,与母本ScFv比较,稳定性有明显提高。这种具有特异抗原结合活性的稳定ScdsFv蛋白的获得为其进一步的功能研究提供了材料。

摘要：为了探讨运用蛋白全长和多肽抗原制备抗狂犬病毒磷蛋白抗体的可能性,本研究运用生物信息学专业软件对二级结构、表面可及性、亲水性和抗原指数进行综合分析,并预测出狂犬病毒磷蛋白的抗原表位.分析结果表明,抗原表位主要位于狂犬病毒磷蛋白的区段14-37、39-66、70-91、106-114、134-158、161-173、187-201、207-221、229-234、236-244、249-258、278-297及以上区段附近.同时,本研究构建了狂犬病毒磷蛋白基因的真核表达载体,转染细胞进行真核表达后,能够被抗狂犬病毒阳性血清所识别,说明磷蛋白上存在大量有效的抗原表位.多个参数对狂犬病毒磷蛋白的抗原表位的预测,为进一步开展狂犬病毒磷蛋白的单克隆抗体制备、结构特征以及表位鉴定工作奠定理论基础.

摘要：目的:将狂犬病毒G蛋白(rabies virus Gprotein,RVG)基因片段克隆到原核表达载体中,表达并纯化GST融合G蛋白,为研制狂犬病新型ELISA抗体检测试剂盒提供诊断抗原。方法:根据GenBank发表的狂犬病病毒CVS-11株G蛋白结构基因序列设计引物,利用RT-PCR扩增出RVG基因片段,并定向克隆于pGEX-6P-1载体中,构建原核表达载体pGEX-RVG。阳性重组质粒转化宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,通过对表达条件的优化,确定可溶性表达的最佳条件。利用谷胱甘肽转移酶(GST)亲和层析法获得纯化的目的蛋白,Western blot对表达的蛋白进行鉴定。结果:构建了原核表达载体pGEX-RVG,经IPTG诱导后可表达分子量约36 000融合蛋白,经纯化获得高纯度的目的蛋白。Western blot检测表明重组的融合蛋白有较好的生物学活性。结论:成功表达并纯化狂犬病毒G蛋白,为进一步研制狂犬病新型ELISA抗体检测试剂盒提供抗原。

摘要：根据独特型与抗独特型的免疫网络与免疫调节学说，利用狂犬病毒作为免疫原，设计了不同的动物免疫方案，免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，免疫脾细胞与骨髓瘤细胞经一次融合，同时获得了分泌抗狂犬病毒单克隆抗体杂交瘤及分泌狂犬病毒抗独特型单克隆抗体杂交瘤，为抗独特型抗体的制备开辟了一条简捷经济的途径。

摘要：目的：探讨狂犬病毒Ｎ蛋白的免疫原性。方法：采用生物工程技术、基因重组方法。结果：以狂犬病毒基因文库及ＩＬ２基因文库设计两对引物，基因扩增后分别得到完整狂犬病毒Ｎ蛋白基因片段（１．４ｋｂ）和ＩＬ２基因片段（０．４ｋｂ），两基因片段经重组后，构建了狂犬病毒Ｎ蛋白及ＩＬ２重组基因工程菌。重组基因产物具有特异性生物活性。用ＩＬ２单抗检测有一定ＩＬ２活性。免疫小鼠后，小鼠可抵抗狂犬病毒脑内攻击。结论：采用的载体及方法、路线可行，重组产物具有生物活性。

摘要：目的建立RT-nested-PCR方法,用于检测可疑狂犬唾液中的狂犬病毒,为狂犬病的快速诊断提供一种新思路。方法根据N基因的保守区序列设计2对引物,通过反应条件的优化,建立RT-nested-PCR的方法,以扩增狂犬病毒的N基因,并用该方法检测可疑狂犬唾液中的狂犬病毒。结果该方法的最小RNA检出量可达11.2fg,并具有较好的特异性和重复性。结论建立的RT-nested-PCR检测法,特异性强,敏感度高,结果可靠,操作便捷,值得推广应用。

摘要：目的 :利用蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)调节亚基(R亚基)的二聚体化功能结构域(DDD)的二聚化功能,制备具有中和活性的人源特异性抗狂犬病毒二价抗体。方法:优化合成linker-C-DDD序列,设计引物扩增抗狂犬病毒抗体Fab094的Fd段和轻链可变区序列(Vκ),通过overlap PCR将Fab094的Fd段和linker-C-DDD基因重组为Fd-DDD,将其和Vκ分别克隆到真核表达载体中,共转染293Free style细胞,表达纯化该抗体。应用SDS-PAGE、Western blot、ELISA、免疫共沉淀、亲和力测定及免疫荧光试验检测该抗体的免疫学特性,用荧光抗体病毒中和试验检测其中和活性。结果:成功构建了全人源抗狂犬病毒二价抗体Fab094-DDD的真核表达载体,获得的二价Fab094-DDD抗体与抗原保持着较好的亲和力,能特异性结合狂犬病毒,中和效价为213.2 U/mg。结论:成功制备了抗狂犬病毒二价Fab094-DDD抗体,具有较高的中和活性,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础,对于其他疾病双表位人源特异性抗体的制备也具有借鉴作用。