摘要：猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是近年来新发的一种猪肠道冠状病毒,具有跨物种传播的能力,严重威胁人类和动物健康。为了解PDCoV的致病机制、建立快速检测方法,对PDCoV E蛋白进行原核表达。以PDCoV HNZK-04毒株为模板设计PDCoV E基因的特异性引物,扩增目的基因并克隆至原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,并对E蛋白的抗原性进行鉴定。结果显示,成功克隆了大小为252 bp的E基因,构建了重组表达载体pET-32a-PDCoV-E。SDS-PAGE结果表明,成功表达了大小约为30 kDa的重组E蛋白,western blot显示目的蛋白具有良好的反应原性。综上所述,成功构建了PDCoV E蛋白重组质粒并表达了目的蛋白,且重组蛋白具有良好的反应原性,可为PDCoV诊断方法的建立以及进一步研究E蛋白的功能奠定了基础。

摘要：为了解河南省部分地区猪流行腹泻病毒(PEDV)和猪δ冠状病毒(PDCoV)的流行状况,根据GenBank中登录的PEDV M基因及PDCoV M基因序列,分别设计扩增引物,采用单一RT-PCR方法对2017年3月至2018年1月采集的154份样品进行检测。结果显示,PEDV的阳性率为51.92%,PDCoV的阳性率为35.06%,混合感染率为24.03%。说明PEDV和PDCoV是普遍存在于腹泻猪群中的病毒,是引起河南仔猪腹泻的重要原因。

摘要：【背景】猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)和猪轮状病毒(porcinerotavirus,PoRV)是当前导致猪群发生病毒性腹泻的4种主要病原,并且常发生混合感染。【目的】建立一种可鉴别诊断这4种腹泻病毒病的检测方法,对于临床诊断具有重要意义。【方法】针对PEDV的M蛋白基因、TGEV的N蛋白基因、PDCoV的N蛋白基因和PoRV的VP7蛋白基因分别设计特异性引物,进而构建相应的重组质粒标准品。通过对PCR反应条件优化,建立可同时检测PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV的多重RT-PCR检测方法。随后通过敏感性、特异性和重复性试验对该方法的有效性进行验证。【结果】敏感性试验结果显示,对PEDV-M、TGEV-N、PDCoV-N和PoRV-VP7重组质粒标准品的最低检测下限分别为1.75×10^(2)、1.5×10^(3)、1.6×10^(2)和1.6×10^(2)copies/μL;特异性试验结果显示,仅可检出本研究中的4种靶病毒,而猪群常见病毒CSFV、PRRSV、PCV2和PRV未能检出。重复性试验结果显示,选取10^(8)、10^(6)和10^(4)copies/μL3个不同浓度的重组质粒作为模板,其他条件不变,分别进行5次重复试验,5次试验均扩增出清晰、均匀的条带。对山东各地区送检的52份临床腹泻样品通过建立的四重RT-PCR方法进行检测,发现PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV的阳性率分别为37%(19份)、6%(3份)、10%(5份)和25%(13份)。其中PEDV和PoRV混合感染2份(4%),PEDV和TGEV混合感染2份(4%),PEDV和PDCoV混合感染1份(2%)。通过单重RT-PCR对该多重RT-PCR临床样品检测结果进行重复验证,结果显示多重RT-PCR与常规单重RT-PCR结果符合率为100%。最后随机挑选5个检测为阳性的临床样本进行测序验证,结果均为相应病毒的基因片段。【结论】本研究建立了可同时检测PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV的四重RT-PCR检测方法,研究结果为临床4种猪腹泻病毒病的鉴别诊断及流行病学调查提供了技术手段。

摘要：本试验旨在采用CRISPR/Cas9技术获得整合素αV(IntegrinαV,ITGαV)及整合素β3(Integrinβ3,ITGβ3)基因敲除的猪睾丸(Swine testicle,ST)细胞系,进而在细胞水平上研究ITGαV及ITGβ3在猪δ冠状病毒(Porcine deltacorovirus,PDCoV)入侵过程中的作用及相互作用机制。根据GenBank上猪的ITGαV及ITGβ3基因序列分别设计三对引导RNA(sgRNA),并整合到LentiCRISPR‐V2载体上,与辅助质粒pSPA×2及pMD2.G共转染293 T细胞进行慢病毒包装,包装完成后感染ST细胞并用嘌呤霉素进行压力筛选。用T7酶进行酶切检测,选出编辑效率较高的细胞群体,进一步用有限稀释法筛选出单克隆敲除细胞系。对分离出的ST‐ITGαVKO(敲除ITGαV基因的ST细胞)及ST‐ITGβ3KO(敲除ITGβ3基因的ST细胞)的单克隆细胞系进行测序和Western Blotting鉴定,结果显示ITGαV与ITGβ3均被成功敲除。采用敲除细胞系进行PDCoV感染试验,结果表明敲除ITGαV、ITGβ3基因均可抑制PDCoV在ST细胞内的增殖,成功构建的ST‐ITGαVKO及ST‐ITGβ3KO细胞系为后续阐明ITGαV、ITGβ3在PDCoV入侵过程中的作用提供了细胞模型。

摘要：为了建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)和猪A群轮状病毒(GAR)的多重RT-PCR实验室检测方法。参照GenBank中登录的PEDV、TGEV和PDCoV N基因和GAR VP7基因的保守序列,设计4对特异性引物,通过优化扩增程序和反应体系,建立检测这4种病毒的多重RT-PCR方法。结果表明,该方法对PEDV、TGEV、PDCoV和GAR有特异性扩增;4种重组质粒最低检测量分别为8.7、9.8、1250、12.1拷贝/μL。对江西省部分地区猪场的30份腹泻猪的肠道样品和粪便样品进行检测,发现PEDV、TGEV和GAR的检出率分别为66.7%、3.3%、6.7%;其中检出PEDV、TGEV和GAR混合感染1份,PEDV和GAR混合感染2份。该检测方法特异性强,重复性与敏感性高。