摘要：目的:尝试应用RNA干扰(RNAi)沉默猪源PK-15细胞中的猪内源性反转录病毒(PERV),并通过反转录酶活性及pol基因相对荧光定量PCR检测沉默效果。方法:依据GenBank公布的PERV pol基因序列,采用Invitro-gen公司的BLOCK-iT RNAi Designer软件设计Stealth小干扰RNA(siRNA)序列;将合成的siRNA转染PK-15细胞,72 h后检测细胞上清PERV反转录酶活性及细胞内pol基因拷贝数并评价沉默效果。结果:反转录酶活性及pol基因拷贝数检测结果表明,设计的3条Stealth siRNA序列中,位于pol基因3272～3296 bp的序列能有效沉默PERV。结论:RNAi方法可有效使猪源PK-15细胞中的PERV沉默,为进一步研究天然抗病毒分子与PERV的相互作用提供了实验基础,同时也为猪源异种移植研究中去除PERV提供了一种可供尝试的方法。

摘要：背景：研究表明同种瓣膜移植术后发生的退行性变性与其留存的细胞成分激发宿主免疫反应有显著的相关性。目的：采用超高压结合核酸酶洗涤方法处理猪带瓣膜血管。观察瓣膜脱细胞的效果及猪内源性反转录病毒的去除情况。设计、时间及地点：对比观察实验。于2004-04／2005-04在日本国立心血管病中心研究所完成。材料：实验选用月龄1-3个月的健康雄性迷你猪幼猪，体质量3-5kg。方法：无菌条件下取出猪带瓣肺动脉血管。分为3组：对照组：无任何处理。表面活性剂组：将带瓣管道用Triton X-100溶液浸渍、搅拌24h后洗净。超高压处理组：用超高压设备以981MPa超高静水压（4℃）将供体来源细胞压碎。结合核酸酶的消化作用，磷酸盐缓冲液的搅拌洗涤，脱去细胞残片形成带瓣膜血管支架。主要观察指标：光镜下观察支架形态结构，透射电镜下观察支架细胞成分去除和支架纤维保留情况。扫描电镜观察支架表面的超微结构。观察两种方法处理瓣膜的弹性率差异。检测猪内源性反转录病毒前病毒DNA。定量检测超高压脱细胞前后带瓣管道中DNA含量的变化。结果：①超高压处理组瓣叶及瓣根组织表面及内部细胞完全消失。保留了细胞外基质，DNA含量显著降低。表面活性剂组瓣根组织深部的细胞无法渗透、除去。②超高压处理组瓣膜弹性率几乎不变。瓣膜功能保持较好。表面活性剂组瓣膜弹性率增加。③超高压处理组猪内源性反转录病毒被成功灭活，无法测出。表面活性剂组无法将猪内源性反转录病毒灭活。结论：采用超高压脱细胞方法可基本除去支架内细胞成分，可将内源性反转录病毒成功灭活。保持了细胞外基质结构和功能的完整性，脱细胞效果优于表面活性剂方法。

摘要：背景:猪异种移植过程中可能发生猪内源性反转录病毒跨种间传播的潜在危险,由此所带来的异种移植生物安全性问题逐渐受到关注。目的:观察去细胞过程对猪膀胱内源性反转录病毒的影响,以评价猪源性膀胱无细胞基质生物工程材料在异种移植中的生物安全性。设计、时间及地点:基因工程与组织工程动物体内实验,于2006-07/2007-03在中国医学科学院北京协和医院中心实验室完成。材料:正常健康雄性杂种犬8只,随机分为对照组2只,修补组6只,用于膀胱修补替代实验。取材0.5h内的猪新鲜膀胱标本采集自屠宰厂。方法:采用低渗-去污剂洗涤-核酸酶消化法对新鲜猪膀胱进行脱细胞处理,制备膀胱无细胞基质移植物。对照组犬切除50%膀胱后原位直接缝合,不使用任何材料修补;修补组犬切除50%膀胱后,分别用面积约为原膀胱30%,40%,50%的膀胱无细胞基质移植物进行替代修补。分别于移植前及移植后1个月抽取犬静脉血提取RNA和DNA,以猪Beta-actin序列片段扩增产物作为内参照,针对内源性反转录病毒gag区序列,选用特异性引物,采用PCR和RT-PCR法检测上述提取的DNA和RNA是否存在内源性反转录病毒序列片段,并对扩增产物进行测序用于同源性分析。主要观察指标:苏木精-伊红染色观察猪膀胱去细胞效果及DNA含量。PCR及RT-PCR扩增及测序结果。结果:经去细胞处理后,猪膀胱内的细胞成分完全去除,三维纤维支架保持完整,DNA含量低于1%。新鲜猪膀胱PCR和RT-PCR均检测到362bp扩增条带,与Medline公布的内源性反转录病毒有94%的同源性;所制备的生物工程材料膀胱无细胞基质移植物、及其移植前后的犬外周血样本均未检测到内源性反转录病毒序列的表达。结论:低渗-去污剂洗涤-核酸酶消化法制备的膀胱无细胞基质移植物可以去除猪膀胱内源性反转录病毒,能够有效预防内源性反转录病毒在物种间的交叉感染,具有良好的生物安全性,可作为生物工程材料进行异种移植相关实验。

摘要：背景：构建组织工程血管支架的研究多集中于生物可降解支架和脱细胞同种或异种血管支架方面,但存在急需解决的若干问题：如生物可降解支架生物降解速度的控制以及植入脱细胞天然血管支架可能带来供体来源病毒细菌感染受体问题等。目的：采用超高压结合核酸酶洗涤方法（超高压脱细胞技术）处理同种异体血管,观察该方法的脱细胞效果以及猪内源性反转录病毒的去除情况。设计：对比观察实验。单位：日本国立心血管病中心研究所。材料：实验于2004-04/2005-04在日本国立心血管病中心研究所完成。选用健康雄性迷你猪幼猪,由日本九州鹿儿岛JapanFarm食用猪养殖场提供,体质量3～5kg,猪龄1～3个月。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。实验涉及的主要试剂和仪器：Hoechst33258为日本同仁化学研究所产品;超高压设备KOBELCO为神户制钢所产品;PCR为GENEAMPPCRSYSTEM9700产品。方法：实验于2004-04/2005-04在日本国立心血管病中心研究所完成。无菌条件下取出猪降主动脉血管,用超高压设备以981MPa超高静水压（4℃）将供体来源细胞压碎,结合核酸酶的消化作用,PBS的搅拌洗涤,脱去细胞残片形成血管生物支架。主要观察指标：①利用Hoechst33258荧光探针,定量检测超高压脱细胞血管中DNA含量;用JEMl00cx型透射电镜观察血管组织细胞成分去除和支架纤维保留情况;用JBM5200型扫描电镜观察支架的超微结构;100倍光镜下观察血管壁形态结构。即从组织学、分子生物学、免疫组组织化学水平评估超高压脱细胞方法的抗原去除效果。②用PCR方法检测幼猪脱细胞血管中的猪内源性反转录病毒（PERV）前病毒DNA,评估超高压脱细胞方法对以猪内源性反转录病毒为代表的病原微生物的杀灭效果。结果：①血管壁形态结构：血管壁纤维波浪状结构保存完好,组织内的细胞均被除去。②细胞去除效果：透射电镜见细胞成分均已消失。但保留有胶原纤维和弹性纤维。扫描电镜可见细胞已被完全脱去,只剩脱细胞支架。③病原微生物的杀灭效果：经过超高压处理,猪内源性反转录病毒被成功灭活,无法测出。而采用表面活性剂脱细胞组无法将猪内源性反转录病毒灭活。④DNA含量：超高压脱细胞处理前,血管中DNA含量为（31.7±3.5）mg/L;超高压脱细胞处理后,DNA含量为（1.16±0.23）mg/L,DNA含量显著降低（P〈0.01）,提示超高压脱细胞方法已将细胞核及内容物大部分除去。结论：实验证明采用超高压脱细胞方法可基本除去支架内细胞成分,可以将病源微生物杀灭（将猪内源性反转录病毒成功灭活）。