摘要：研究猪肺炎支原体168(Mycoplasma hyopneumoniae 168,Mhp168)弱毒株重组蛋白p65的免疫原性。根据GenBank中Mhp168弱毒株P65基因的开放阅读框设计特异性引物,进行PCR扩增,构建原核表达载体pET-28a-P65,经原核表达并纯化获得的重组蛋白与佐剂以体积比1∶1乳化后免疫注射小鼠,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定小鼠血清的抗体效价;选取抗体效价较高的小鼠进行攻毒试验。经间接ELISA证明,重组蛋白p65具有良好的免疫原性,血清效价为1∶12 800。攻毒试验证明,p65重组蛋白疫苗的保护率可达80%,证明重组蛋白p65具有良好的免疫原性。

摘要：为建立一种用于检测猪肺炎支原体(Mhp)的套式PCR方法,本研究从GenBank中下载Mhp P36基因序列,选取其保守区域基因片段,设计套式PCR的内外套2对特异性引物,经过反应条件优化,建立了Mhp套式PCR检测方法。用该方法对Mhp 168株、鸡毒支原体、猪鼻支原体、猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒进行特异性检测。结果显示,除了Mhp 168株能扩增出外套793 bp和内套448 bp的目的条带,其余病原均未扩增出相应的片段,特异性较强;该方法对Mhp的最低检测限为10拷贝/μL,敏感性是常规PCR方法的100倍。对50份含Mhp的培养基经本研究建立的套式PCR、常规PCR、Mhp分离培养方法的阳性检出率分别为88%、82%、88%,套式PCR方法与常规PCR的总体符合率为94%,与Mhp分离培养方法的符合率为100%。本实验建立的套式PCR方法,为Mhp的流行病学调查提供了检测手段。

摘要：猪肺炎支原体的表面抗原基因 Ｐ４６基因可引起宿主早期特异性免疫反应，其分子量约４６ ｋ Ｄａ。根据 Ｇｅｎ Ｂａｎｋ 公布的 Ｐ４６基因序列设计１对能扩增 １ ３７７ ｂｐ Ｐ４６结构基因的引物（５： Ｇ Ｇ Ｃ Ａ Ａ Ｇ Ｃ Ｔ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ Ｇ Ｔ Ｔ Ｇ Ｔ Ｇ Ｇ Ａ Ｃ Ａ Ｇ Ａ Ｃ Ａ Ｇ，３： Ａ Ｃ Ｃ Ｇ Ｇ Ａ Ｔ Ｃ Ｃ Ａ Ｔ Ｃ Ａ Ｃ Ａ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ａ Ｇ Ｃ）作 Ｐ Ｃ Ｒ，成功地从猪肺炎支原体１６８弱毒株染色体 Ｄ Ｎ Ａ 中扩增出目的基因。 Ｐ Ｃ Ｒ 产物克隆于 ｐ Ｕ Ｃ１９质粒中，部分测序表明克隆基因与 Ｊ株基因同源性达９６％ 。其变异主要表现为 Ａ 碱基缺失或变为 Ｃ碱基；人工致弱株外显子基因中 Ａ、 Ｔ 碱基较 Ｇ、 Ｃ可能有更高的易变性。

摘要：构建猪肺炎支原体P97蛋白的酵母随机展示文库,并利用该文库筛选和鉴定P97蛋白上的特异性B细胞表位。设计特异性引物从Mhp基因组中扩增p97基因,通过PCR方法将基因内部的TGA密码子突变为TGG,用DNaseⅠ将p97突变基因随机消化成长度100~250bp的片段,回收产物经3′端加A处理后与用XcmⅠ酶切的酵母表达载体pCT-XcmⅠ连接,将连接产物转化酿酒酵母EBY100获得P97蛋白酵母随机展示文库。利用流式细胞分选技术筛选出文库中能与Mhp天然感染的猪阳性血清结合的阳性酵母克隆,并进一步鉴定其最小抗原表位。结果:1)克隆计数显示构建的随机文库库容量为2.86×106克隆,所有插入的片段随机分布,覆盖了全长的p97突变基因,文库经诱导后可以利用流式细胞仪检测到与Mhp天然感染的猪阳性血清反应的阳性克隆;2)随后对文库进行流式细胞分选,经鉴定选出184号一个抗原多肽。从短肽C端氨基酸逐个缺失后发现长度为15个氨基酸的184D(DEKTSSQKDPSTLRA)多肽为一个B细胞表位,该表位能与多份Mhp阳性猪血清反应。P97蛋白酵母随机展示文库可以用于抗原表位的筛选鉴定,184D多肽是P97上一个在宿主体内能普遍诱导抗体免疫应答的B细胞表位,本研究对于研发Mhp的表位疫苗和建立特异性诊断方法具有重要意义。

摘要：为建立一种敏感、特异的检测疫苗中猪肺炎支原体污染的方法,设计了猪源支原体PCR通用外套引物和猪肺炎支原体种特异性内套引物及地高辛标记寡核苷酸探针,建立了PCR-斑点杂交技术,应用于猪瘟活疫苗中猪肺炎支原体污染的检测,并与套式PCR技术进行比较研究。结果显示,探针最低检出DNA量为23.4 pg,比套式PCR(最低检出量为62.5 pg)敏感性更高,且探针与鸡毒支原体和大肠杆菌DNA无交叉反应。对来自6个生产厂家共90批疫苗的检测结果显示,PCR-斑点杂交法比套式PCR法对疫苗猪肺炎支原体污染的检出率高10%。以上结果表明PCR-斑点杂交法具有更高的敏感性和特异性,在疫苗猪肺炎支原体污染的检测中具有推广应用价值。

摘要：目的:将猪肺炎支原体P46基因中编码Trp的密码子TGA突变为TGG,为P46蛋白的研究及猪肺炎支原体抗体检测方法的建立奠定基础。方法:参考GenBank登录的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae Mhp)P46基因序列,利用Primer5.0软件设计合成一对引物,对猪肺炎支原体强毒株F60P46基因的编码区进行扩增,后又设计了三对突变引物,通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)对猪肺炎支原体P46基因的三个位点进行定点突变。结果:得到的序列与GenBank中登录的P46基因的核苷酸及氨基酸序列进行序列比较,结果表明它们有较高的同源性。突变后测序结果表明已成功将猪肺炎支原体P46基因中编码Trp的密码子TGA突变为TGG。

摘要：根据猪肺炎支原体P36基因序列,设计1对引物,建立了猪肺炎支原体PCR诊断方法,该方法对猪肺炎支原体的扩增结果为阳性,对照菌株扩增结果均为阴性,对猪肺炎支原体检测的灵敏性为1 pg总DNA量。并用建立的PCR诊断方法检测52份猪肺炎支原体疑似病料,检出阳性病例18份,以上结果表明该PCR方法特异性强敏感性高、简便、快速,可用于猪肺炎支原体疾病的诊断。

摘要：本试验通过深入了解广西陆川猪猪肺炎支原体（Mhp）地方流行毒株的黏附因子P97基因R1区的序列特征、基本结构及遗传变异等特点,为广西地方品种陆川猪猪支原体肺炎（MPS）有效的综合防控措施提供理论依据,并为进一步研究广西陆川猪Mhp地方流行毒株特性打下坚实的基础。参考Mhp基因组序列设计扩增P97基因R1区的1对引物,以2011年—2014年广西陆川猪MPS阳性病料为研究对象,提取基因组DNA,PCR扩增P97基因R1区,对PCR产物进行测序,将广西陆川猪Mhp不同地方流行毒株的P97基因R1区序列的碱基组成和推导的氨基酸序列进行比对。DNAStar软件分析结果表明,所获得的15株广西陆川猪Mhp毒株（GXLC-1、GXLC-2、GXLC-3、GXLC-4、GXLC-5、GXLC-6、GXLC-7、GXLC-8、GXLC-9、GXLC-10、GXLC-11、GXLC-12、GXLC-13、GXLC-14、GXLC-15）和3株广西其他品种猪Mhp毒株（GX227、GX595、GX674）的P97基因R1区的多处碱基发生变异。通过推导氨基酸序列统计P97R1区五氨基酸（AAKPV/E）重复数为9~18,平均值为12,TN重复数为1~4,结果发现广西陆川猪Mhp流行毒株变异使其毒力和黏附能力增强,再加上陆川猪呼吸道短小狭窄的特殊结构,更易导致广西陆川猪MPS的发生。

摘要：猪呼吸道病综合征是一种多因子性疾病。通过设计1对针对16s rDNA的引物,建立了该病原的PCR检测方法,该方法能从标准株和分离株中获得阳性扩增,但不会与其他种类支原体或者是猪呼吸道中的常见微生物发生交叉反应。为证实扩增产物的特异性,对2个PCR产物进行纯化、测序和序列分析,证实为肺炎支原体。

摘要：为克隆和表达猪肺炎支原体(Myeoplasma hyopneumoniae)地方毒株Z株P97-R1基因,探索不同菌株P97-R1基因的差异及其蛋白作为诊断抗原的可能性。本研究根据GenBank登陆的猪肺炎支原体(Mhp)232株P97基因,使用Primer Permier 5.0和DNAman设计引物,以猪肺炎支原体地方毒株Z株基因组DNA为模板,用PCR方法扩增出了P97-R1基因片段,并将该基因片段连接到T-easy和pET-32a载体上分别进行测序和原核表达。测序结果表明:与参考株232株序列对比分析发现Z株P97-R1区发生了多处碱基突变;经DNAstar软件分析表明Z株包含11个5aa重复序列,232株P97-R1区包含15个5aa重复序列,推测Rl重复序列的差异与菌株毒力强弱有关。Z株P97-R1基因原核表达产物经SDS-PAGE分析,得到了分子量约为30KD的蛋白,经Western-blot鉴定表明该表达蛋白具有免疫原性。这为Mhp的诊断、预防及进一步深入研究奠定了基础。