摘要：利用实验设计(design of experiment,DoE)方法建立抗CD38单抗(monoclonal antibody,mAb)的抗体依赖性细胞吞噬作用(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis,ADCP)生物学活性检测方法。以Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ转基因细胞系作为效应细胞,Daudi细胞系作为靶细胞,通过荧光素酶检测系统(BrightGlo^(TM)Lucifer‐ase Assay system)检测抗CD38单抗的ADCP生物学活性,并运用DoE方法进行实验参数优化。结果显示,抗CD38单抗在该方法中存在量效关系,且符合四参数方程:y=(A-D)/[1+(x/C)^(B)]+D,方法经统计学实验设计对多个实验参数进行筛选和优化,确定抗体工作浓度为800~20.81 ng·mL^(-1),靶细胞和效应细胞的接种量分别为每孔7.5×10^(4)和2.5×10^(4)个,诱导时间为6 h。该方法具有良好的专属性;5个不同组回收率样本经3次检测,相对效价分别为(59.97±4.74)%、(82.44±5.15)%、(110.69±11.71)%、(129.23±5.22)%和(162.15±3.66)%;回收率在103%~120%,RSD均小于11%,线性检测范围为50%~150%。本研究利用DoE设计成功筛选、优化和建立基于报告基因的抗CD38单抗ADCP生物学活性测定方法,该方法具有良好的专属性、重复性和准确性,可作为抗CD38单抗ADCP生物学活性的评价方法。

摘要：目的利用实验设计(design of experiment,DOE)建立抗程序性死亡因子1(programmed cell death 1,PD-1)及其配体(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)单抗基于报告基因的抗体依赖细胞介导的细胞毒效应(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)生物学活性优化及验证方法。方法利用Jurkat-hFcγRⅢa-NFAT转基因细胞系作为效应细胞,分别以293FT-PD-1细胞系和CHO-PD-L1细胞系作为靶细胞,通过荧光素酶检测系统(Bright GloTM Luciferase Assay system)建立抗PD-1/PD-L1单抗的ADCC生物学活性检测方法,并运用DOE方法进行试验优化和方法学验证。结果抗PD-1/PD-L1单抗在该方法中存在量效关系,且符合四参数方程:y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D,方法经优化后确定抗体量效范围分别为10 000~4. 833 ng·m L^-1和2 000~0. 488 ng·m L^-1,效靶比(effect target ratio,E∶T)为分别为6∶1和3∶1,诱导时间均为20 h。该方法具有良好的专属性;抗PD-1单抗4个不同稀释组回收率样本经3次检测,相对效价分别为(51. 74±2. 22)%、(77. 12±3. 14)%、(118. 71±2. 83)%和(156. 20±12. 99)%;对应的回收率分别为(103. 49±4. 44)%、(102. 83±4. 19)%、(94. 96±2. 26)%和(104. 14±8. 66)%,抗PD-L1单抗4个不同稀释组回收率样本经3次检测,相对效价分别为(54. 32±4. 75)%、(75. 24±4. 25)%、(127. 40±2. 43)%和(156. 82±3. 27)%;对应的回收率分别为(108. 64±9. 51)%、(100. 33±5. 67)%、(101. 92±1. 94)%和(104. 55±2. 18)%,上述结果的RSD均小于10%。结论本实验利用DOE设计成功建立基于报告基因的抗PD-1/PD-L1单抗ADCC生物学活性的优化及验证方法,该方法专属性强、重复性好,准确性高,可作为抗PD-1/PD-L1单抗ADCC生物学活性的评价方法。

摘要：随着抗生素在饲料中滥用导致的问题日趋严重,抗菌肽因其分子量小、抗菌谱广、抗菌活性高、耐热性强、不易产生抗药性、对高等生物正常细胞无毒害等优点已成为安全绿色抗生素添加剂替代品的理想选择。随着对抗菌肽结构、功能与杀菌机理研究的深入,人们开始尝试通过各种生物学手段设计杀菌活力更强、抗菌谱更广的杂合抗菌肽。从杂合抗菌肽的设计、生物学活性以及未来的研究方向等方面综述了杂合抗菌肽的研究进展。

摘要：目的利用报告基因法建立抗人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)单抗的抗体依赖性细胞吞噬作用(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis,ADCP)生物学活性检测方法。方法以Jurkat/NFAT/CD32a-FcεRIγ转基因细胞系作为效应细胞,SKBR3细胞系为靶细胞,通过荧光素酶检测系统建立抗HER2单抗的ADCP测活方法,并运用实验设计(design of experiment,DOE)方法进行实验优化和方法学验证。结果该方法量效关系符合四参数方程:y=(A-D)/[1+(x/C)^(B)]+D,方法优化确定量效范围为400~3.959 ng·mL(-1),靶细胞接种密度为每孔1.5×10^(4)个,效靶比为5∶1,诱导时间为7 h。该方法具有良好的专属性;不同稀释组样本百分相对效价分别为(55.04±1.35)%、(78.10±6.33)%、(102.69±5.21)%、(133.32±2.58)%和(152.87±8.11)%;回收率在101%~110%,相对标准偏差(RSD)均小于10%。结论本研究成功建立抗HER2单抗ADCP生物学活性方法,该方法专属性强、重复性好,准确性高,可作为抗HER2单抗ADCP生物学活性的评价方法。

摘要：目的:设计一种高活性、低副作用的降钙素类似物。方法:根据生物活性肽药物设计原理,结合前人的工作经验,提出提高降钙素分子等电点(pI)、增加N-末端疏水性和C-末端亲水性可以提高新型降钙素活性的假设。以人和鲑鱼降钙素为先导物,设计了大量的降钙素类似物,然后利用蛋白质分析计算软件,逐一分析,综合考虑到副作用与活性的矛盾,确定符合要求的新型降钙素类似物。结果:最终确定的符合要求的降钙素类似物为人和鲑鱼嵌合降钙素(hsCT)。结构预测结果显示新型降钙素类似物符合鲑鱼降钙素的空间构象,其pI值介于人源与鲑鱼源降钙素之间;N-末端疏水性比人降钙素有所增加,与鲑鱼降钙素相当;C-末端疏水情况与鲑鱼降钙素相同。C-末端亲水性与人降钙素比较有很大程度的增加。结论:新型嵌合降钙素活性高于人降钙素,而副作用较鲑鱼降钙素降低。

摘要：根据大肠杆菌Ee株主要免疫原性片段SLT-ⅡeB的基因序列,设计合成两对引物,利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)表达系统将三拷贝SLT-ⅡeB的融合基因串联于GST下游,并在大肠杆菌中成功表达,获得了大小约为45kDa融合蛋白GST-3B,表达产物以包涵体形式产生,Western blot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性;结合抑制试验表明,与单拷贝融合表达蛋白GST-B相比,GST-3B与水肿毒素受体的亲和力更强。GST-3B及GST-B与等量弗氏不完全佐剂乳化后制成亚单位疫苗,间隔两周两次皮下免疫小鼠。结果GST-3B疫苗组产生的抗体水平明显高于GST-B疫苗组,但两种疫苗组的抗体消长趋势相同。二免后两周用5×LD50的Ee株大肠杆菌进行腹腔攻毒。GST-3B疫苗组保护率为60.0%(6/10),明显优于GST-B疫苗组40.0%(4/10)。研究结果表明GST-3B具有良好的生物学活性和免疫原性,可以作为疫苗添加成分,显示了良好的应用前景。

摘要：金属硫蛋白(metallothionein,MT)在去除重金属、抗氧化和免疫调节等方面发挥重要作用。当前获取天然MT蛋白的首选方法是从组织中提取,工艺复杂且收率很低。近年来涌现多种标签融合后异源表达的设计,如GST或His等。然而后期标签的去除大大降低了收率,因此难以实现工业化生产。类弹性蛋白(elastin-likepolypeptides,ELPs)融合技术能够实现目标蛋白的可溶性表达且纯化工艺简便快捷。本研究将ELP与MT蛋白融合,通过ELP融合显著增加了MT的可溶性表达,采用多次可逆相变循环(inverse transition cycling,ITC)处理等纯化工艺高效简便地获得了纯度97%以上的ELP-MT蛋白。获得的ELP-MT蛋白2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐[2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)ammonium salt,ABTS]自由基清除率IC_(50)为0.77μmol/L,为维生素E衍生物Trolox的53.7倍,同时表现出较强的1,1-二苯基-2-三硝基肼(1,1-diphenyl-2-trinitrohydrazine,DPPH)自由基清除能力。并且ELP-MT对小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3细胞无增殖毒性,可显著促进NIH/3T3细胞黏附和迁移,具有良好的生物相容性。本研究构建的ELP-MT融合蛋白同时具有金属硫蛋白和弹性蛋白的特性,为重组MT蛋白的规模化生产和其在食品保健及化妆品领域的应用开发奠定了技术基础。

摘要：目的设计具有更高生物学活性的睫状神经营养因子突变体,并对其进行表达、纯化及生物学活性检测。方法以计算机分子模拟系统设计突变体,重叠延伸PCR方法获得突变体的编码区DNA序列,克隆入表达载体pThioHisA,转化***21,以IPTG诱导表达。复性纯化后,用鸡胚背根神经节无血清培养法和小鼠减重法进行生物学活性测定。结果目的蛋白以包涵体形式存在,表达量在35%以上,纯化后的纯度达95%以上,能有效地促进鸡胚背根神经节的生长,并能使正常小鼠的体重降低,脂肪指数下降。结论所设计的突变体经表达及纯化后,具有良好的生物学活性,为进一步研究突变体蛋白的促神经生长和减肥作用奠定了基础。

摘要：目的:构建表达人PD-1Δex3(ΔPD-1)基因的真核表达载体,检测其表达和生物学活性。方法:通过RT-PCR的方法获得人PD-1全长(PD-1)基因,设计特异性引物,PCR方法获得PD-1Δex3基因的2个cDNA片段,通过重组PCR的方法获得ΔPD-1基因,将目的片段双酶切后与pIRES2-EGFP真核表达载体连接,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP/PD-1和pIRES2-EGFP/ΔPD-1并进行鉴定;脂质体转染法将重组载体导入293T细胞;流式细胞术(FCM)检测转染细胞膜表面PD-1的表达;Western blot法检测培养上清中可溶性PD-1(sPD-1)的表达;间接免疫荧光实验分析ΔPD-1蛋白与PD-1两个配体PD-L1和PD-L2的结合。结果:酶切和测序结果均证实插入的基因序列正确,成功构建两个真核表达载体;FCM分析和Western blot检测结果表明,PD-1转染细胞膜表面高表达PD-1蛋白,细胞培养上清中无sPD-1蛋白,而ΔPD-1转染细胞膜表面不表达PD-1蛋白,细胞培养上清中则有大量sPD-1;间接免疫荧光实验结果表明,ΔPD-1蛋白能够与PD-1两种配体产生特异性结合。结论:成功进行PD-1Δex3基因的真核表达,证实PD-1Δex3基因编码sPD-1蛋白,该蛋白具有良好的生物学活性,为进一步研究PD-1Δex3在PD-1/PD-L信号通路中的生物学作用提供了有价值的物质基础。

摘要：目的克隆葡萄球菌肠毒素O（seo）基因，构建其两种原核表达载体，表达、纯化重组蛋白SEO，并对其生物活性进行初步研究。方法设计引物PCR获得seo成熟肽基因，将其分别克隆至原核表达载体pGEX-6P-1、pET28a，转化*** BL21、*** BL21（DE3），重组蛋白分别经GST亲和层析、镍螯合层析纯化，利用Westernblot验证重组SEO的免疫原性，MTT法测定重组SEO对ICR小鼠脾淋巴细胞的增殖作用，Caspase3酶活及DNA电泳分析重组SEO诱导细胞凋亡的能力。结果克隆的seo基因序列与报道的序列完全相同。纯化获得重组蛋白GST—SEO和P28-SEO的表达量分别占菌体蛋白的25％和22％。免疫印迹表明两种蛋白均具有良好的免疫原性。生物活性检测表明，低剂量的肠毒素对小鼠脾淋巴细胞有刺激增殖作用，较高剂量则会导致细胞凋亡。结论两种重组的SEO仍具有超抗原的活性，对小鼠脾淋巴细胞具有诱导凋亡的能力。