摘要：目的:探究Rab1A基因表达的改变对乳腺癌细胞MDA-MB-231恶性生物学行为的影响。方法:Western blot检测Rab1A在乳腺癌组织及癌旁正常组织的表达和Rab1A在乳腺正常上皮及不同乳腺癌细胞系中的基础表达。设计并构建靶向Rab1A的小干扰RNA(siRNA),Western blot法验证敲减效果;分别采用CCK-8实验、划痕实验、Transwell实验、流式细胞术和Western blot观察Rab1A基因表达改变对乳腺癌MDA-MB-231细胞恶性生物学行为的影响和相关蛋白表达的改变。结果:Rab1A在乳腺正常组织和细胞中低表达,在癌组织及癌细胞中高表达(P<0.05);与对照组相比,干扰Rab1A的表达可以显著抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的活力(P<0.05),诱导凋亡增加(P<0.05),G_2/M期细胞比例增加(P<0.05),迁移与侵袭能力减弱(P<0.05),p53、Bax、cleaved caspase-3和PTEN的蛋白水平升高(P<0.05),Bcl-2、cyclin D1、cyclin B1、基质金属蛋白酶2(MMP2)、p-AKT和mTOR的蛋白水平降低(P<0.05)。结论:Rab1A具有调控乳腺癌细胞生长、迁移、侵袭、细胞周期和凋亡的能力,并调控增殖、周期和凋亡相关蛋白的表达。干扰Rab1A可通过抑制AKT通路的磷酸化从而抑制乳腺癌的演进与发展;Rab1A可能是基因治疗乳腺癌的一个潜在靶点。

摘要：本研究通过构建β-连环蛋白(β-catenin)特异的RNAi慢病毒表达载体,探讨阻断Wnt/β-catenin信号通路对骨髓间充质干细胞(MSC)生物学行为的影响。设计3对针对β-catenin mRNA不同位点的shRNA编码序列,分别连接到慢病毒载体质粒PLB中,构建PLB-β-catenin/shRNA1,PLB-β-catenin/shRNA2和PLB-β-catenin/shRNA3;将重组质粒与慢病毒包装质粒及包膜蛋白质粒共转染293FT细胞,收获病毒颗粒,浓缩后测定病毒滴度,感染MSC细胞,并应用流式细胞术分选GFP阳性细胞,Western blot和RT-PCR验证其对细胞内β-catenin基因表达的抑制效果,筛选干扰效率最高质粒;CCK-8法检测细胞增殖,Annexin-V/7-AAD法检测干扰后细胞凋亡情况,细胞划痕实验及Transwell实验检测MSC迁移能力。结果表明:构建的特异性慢病毒siRNA干扰组(PLB-β-catenin/shRNA2)能有效抑制β-catenin的mRNA和蛋白表达,并抑制细胞的增殖;而空载体对照组(PLB group)和正常对照组(control group)细胞增殖无明显变化,两组之间无显著的统计学差异(P>0.05);流式细胞术检测结果显示,采用血清饥饿法处理后,干扰组细胞的凋亡率明显增加,但两对照组之间无统计学差异(P>0.05);细胞划痕和Transwell实验显示,干扰组MSC的迁移能力明显降低,对照组细胞迁移能力无明显变化。结论:构建的特异RNAi慢病毒能够有效抑制β-catenin基因的表达,减少细胞内目的基因mRNA和蛋白的水平,从而对MSC细胞的增殖、凋亡和迁移能力产生重要影响。

摘要：近年,对于基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)与肿瘤发生发展的关系有了新的诠释,MMPs的功能已不仅限于通过降解细胞外基质来促进肿瘤的侵袭和转移,它们还可通过水解生长因子、黏附分子、受体等非基质蛋白而触发一系列生物学效应,调节肿瘤的生长、分化、凋亡以及肿瘤的血管生成和免疫逃避。重新认识MMPs的功能,将有助于设计以MMPs为靶标的新型抗肿瘤药物。

摘要：目的:构建针对人γ-synuclein基因的shRNA真核表达载体,观察γ-synuclein基因对人结肠癌细胞系体外生物学行为的影响。方法:根据人γ-synuclein序列设计并构建γ-synuclein基因的shRNA真核表达载体,以脂质体转染的方法将γ-synuclein干扰质粒转染至人结肠癌细胞株HCT116,经G418筛选出稳定转染的细胞株。应用CCK8法检测γ-synuclein干扰对HCT116细胞增殖的影响,软琼脂克隆形成实验检测细胞体外克隆形成能力,细胞划痕实验检测细胞体外迁移能力,Transwell小室法检测细胞体外侵袭能力。结果:经测序证明γ-synuclein的shRNA序列已成功插入pGCsi-U6/neo/GFP质粒中,构建的干扰质粒能够显著抑制γ-synuclein mRNA及蛋白的表达。γ-synuclein受抑制后,HCT116细胞增殖数目从48h后开始减少,持续72h,与空质粒组及未转染组相比,差异均有统计学意义,P<0.05。siRNA组细胞克隆形成率为(9.6±2.9)%,显著低于未转染组的(29.4±4.5)%和空质粒组的(32.1±5.8)%,差异均具有统计学意义,P<0.05。在细胞划痕实验中,γ-synuclein被抑制后细胞划痕损伤愈合的速度明显减慢。在侵袭实验中,穿过Matrigel胶及Transwell小室膜的siRNA组侵袭细胞数为20.1±5.26,显著低于未转染组的100和空质粒组的105.4±12.5,差异均有统计学意义,P<0.05。结论:干扰γ-synuclein的表达可显著抑制结肠癌细胞体外增殖、克隆形成和迁移侵袭能力。

摘要：目的肿瘤的发生、发展和侵袭转移是影响结肠癌治疗的重要原因,有研究发现DNA甲基化状态在肿瘤的发生、发展中起着重要作用,抑制T-cadherin表达可增强肿瘤细胞侵袭和迁移能力。本研究探讨siRNA敲减DNA甲基转移酶1(DNA methyl transferase 1,DNMT1)基因表达对结肠癌细胞T-cadherin基因甲基化及细胞生物学行为影响。方法设计针对DNMT1的siRNA1、siRNA2和siRNA3重组质粒,分别转染HT-29、SW620和HCT116细胞系,采用实时荧光定量PCR检测DNMT1表达,以筛选敲减效率最高的DNMT1siRNA和细胞系。用敲减效率最高的DNMT1siRNA转染相应细胞系,采用甲基化特异性PCR检测T-cadherin甲基化水平,采用实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测T-cadherin表达。用敲减效率最高的DNMT1siRNA转染相应细胞系,采用噻唑蓝比色法、流式细胞术、Transwell和细胞划痕实验检测细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移情况,观察敲减DNMT1对细胞生物学行为的影响;同时设置T-cadherin shRNA重组质粒转染组,观察同时敲减DNMT1和T-cadherin对细胞生物学行为的影响。结果 DNMT1siRNA1重组质粒对HT-29细胞系DNMT1的敲减效果最好。DNMT1siRNA1转染HT-29细胞后,DNMT1组T-cadherin基因甲基化水平明显低于空质粒组和空白组,DNMT1组与空质粒组(F=314.182)和空白组(F=283.625)差异有统计学意义,均P0.05。结论 DNMT1siRNA1可有效敲减HT-29细胞DNMT1表达,逆转T-cadherin高甲基化状态并上调其表达。敲减DNMT1可明显抑制HT-29细胞增殖,促进其凋亡,降低其侵袭和迁移能力;而同时敲减T-cadherin能够逆转此种现象,说明敲减DNMT1引起的细胞生物学行为改变可能是通过T-cadherin来实现的。

摘要：目的观察小干扰RNA（siRNA）抑制大鼠垂体生长激素腺瘤细胞（GH3）中垂体特异转录因子．1（Pit-1）的基因表达对其生物学行为的影响。方法设计合成针对Pit-1基因的siRNA，经脂质体包裹转染GH3细胞。采用Westernblot、逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法测定经siRNA转染24h后；Pit．1蛋白和Pit-1mRNA表达；用细胞计数试剂盒（CCK-8）细胞增殖-毒性检测法检测细胞生长增殖的变化；用流式细胞仪检测细胞凋亡的改变；制备Transwell小室测定GH3细胞体外侵袭能力的变化。结果siRNA显著地抑制Pit-1蛋白和Pit-1mRNA的表达水平，分别降低58．18％和75．82％；CCK．8法结果显示siRNA组细胞增长率明显低于与阴性对照组；流式细胞仪分析显示，siRNA组细胞凋亡率[（9．25000±0．99695）％]较阴性对照组[（2．89330±0．66516）％]增加；，siRNA组穿过Matrigel胶及滤膜的细胞数[（92．91±53．25）个]，与阴性对照组[（7．50±7．95）个]比较侵袭力明显减弱，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论Pit-1siRNA能够有效地抑制GH3细胞的生长、促进其凋亡，降低侵袭力。

摘要：目的构建并观察靶向β-连环蛋白(β-catenin)的shRNA慢病毒对儿童髓母细胞瘤(MB)细胞株生物学行为的影响。方法 (1)设计靶向β-catenin的shRNA 1、2、3和阴性对照(NC),分别插入p CH-CMV-MCS-EF1-cop GFP质粒中,通过慢病毒包装后获得相应的重组慢病毒。(2)培养儿童MB细胞株DOAY并分为Lentivirus(LV)-shRNA 1、2、3、NC组和空白对照组(Blank),前4组感染相应的重组慢病毒,Blank组未感染病毒,感染72 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达,通过RT-PCR和Western Blot检测各组细胞中β-catenin的表达情况,选取对β-catenin抑制效果最佳的LVshRNA,用嘌呤霉素分别筛选稳定感染该LV-shRNA和LV-NC的DOAY细胞系。(3)设3组,LV-shRNA组和LV-NC组为筛选得到的稳定感染的细胞系,Blank组为未感染病毒的细胞,采用MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Transwell实验检测细胞侵袭能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果 (1)LV-shRNA 1、2、3组β-catenin的mRNA和蛋白表达均低于LV-NC组和Blank组,LV-shRNA 1组低于LV-shRNA 2、3组,差异均有统计学意义(P<0.05),以4μg·m L-1嘌呤霉素筛选得到稳定表达LV-shRNA 1和LV-NC的DOAY细胞株。(2)与LV-NC和Blank组比较,LV-shRNA1组MTT实验第12、24、36、48、72 h时的OD值较低,细胞总凋亡率较高,穿膜细胞数目较少,细胞迁移距离较短,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论慢病毒介导shRNA抑制β-catenin后,能显著抑制DOAY细胞的增殖能力,降低其侵袭和迁移能力,促进其凋亡。

摘要：目的:探讨转入靶向survivin的siRNA对肝癌细胞生物学行为的影响. 方法:设计、合成一对survivin编码基因的反向重复序列, 中间间隔9个核苷酸序列,通过定向克隆至载体PSilencer2.1, 构建siRNA真核表达载体,经稳定转染HepG2细胞后对转基因后肿瘤细胞的生物学行为进行观察. 结果:测序证实siRNA真核表达载体构建成功.通过RT- PCR及流式细胞术检测,siRNA在mRNA及蛋白质水平抑制survivin基因表达分别达73%和75%.转染细胞生长速度明显减慢,凋亡率增加15倍.裸鼠体内成瘤率下降75%,9-30 d肿瘤体积分别为0.10±0.01 cm3,0.30±0.03 cm3,0.39±0.11 cm3,0.45±0.13 cm3,0.49±0.07 cm3,0.58±0.01 cm3,0.60±0.10 cm3,0.65±0.07 cm3,与对照组相比差异显著(P<0.01). 结论:靶向survivin的siRNA能有效降低目的基因的表达并能在体内体外抑制肝癌细胞株HepG2的生长.为进一步逆转肿瘤细胞的耐药性提供了理论指导.

摘要：目的:探讨Dickkopf相关蛋白3(DKK3)基因高甲基化对直肠癌增殖、迁移及侵袭的影响及其临床价值。方法:SW480、LOVO、HT29及HCT116等直肠癌细胞购自中国科学院细胞库。选择2016年1月至2016年12月直肠癌患者(直肠癌组)及直肠良性疾病患者(对照组)为研究对象。设计合成寡核苷酸序列(MON、UMON和CON)并转染至LOVO直肠癌细胞。采用甲基特异性PCR检测直肠癌患者(肿瘤组织、癌旁组织)、对照组直肠组织及直肠癌细胞系中DKK3基因甲基化状态;分析DKK3基因甲基化与临床病理因素、无进展生存期(PFS)及总生存期的关系;Transwell小室检测MON组、UMON组及CON组LOVO直肠癌细胞迁移及侵袭。两组间均数比较用独立样本t检验;多组间均数比较用单因素方差分析(组间比较用LSD-t检验)。Kaplan-Meier生存分析并采用Log-rank比较。结果:直肠癌组患者肿瘤组织DKK3基因甲基化率显著高于癌旁组织及对照组直肠组织(甲基化率分别72.2%、11.1%比12.0%),差异有统计学意义(χ^(2)=88.756,P<0.05)。SW480、HT29及HCT116等直肠癌细胞系中DKK3基因呈甲基化状态,而在LOVO直肠癌细胞中呈未甲基化状态。低+中分化、N2淋巴结转移、肿瘤最大径≥3 cm、T3+T4及Ⅲ+Ⅳ期患者DKK3基因甲基化率显著高于高分化、N0+N1淋巴结转移、肿瘤最大径<3 cm、T1+T2及Ⅰ+Ⅱ期患者(甲基化率分别79.31%比59.38%、86.11%比62.96%、83.67%比58.54%、83.33%比59.52%、82.76%比53.13%),差异有统计学意义(χ^(2)=5.922、4.673、5.833、5.198、7.610,均P<0.05)。DKK3基因甲基化患者PFS及中位生存期显著低于DKK3基因未甲基化患者[PFS为(24.4±3.8)个月比(33.7±4.1)个月,中位生存期为(31.5±4.2)个月比(42.8±5.4)个月],差异有统计学意义(Log-rank=21.135、30.876,P<0.05)。MON组LOVO直肠癌细胞1~6 d细胞活力、细胞迁移数及侵袭数均显著高于UMON组及CON组LOVO直肠癌细胞[1 d的吸光度(A)值分别为0.21±0.03、0.14±0.03比0.15±0.04、2 d的A值分别为0.31±0.04、0.21±0.04比0.23±0.05、3 d的A值分别为0.42±0.05、0.29±0.05比0.28±0.06、4 d的A值分别为0.57±0.05、0.33±0.06比0.35±0.05、5 d的A值分别为0.71±0.08、0.45±0.06比0.44±0.07、6 d的A值分别为0.89±0.09、0.53±0.08比0.54±0.09,细胞迁移数分别为(687.1±23.5)、(287.5±15.4)个比(285.9±15.1)个;细胞侵袭数分别为(419.6±34.2)、(151.7±14.9)个比(152.6±15.5)个],差异有统计学意义(F=11.382、13.263、14.651、16.128、19.877、21.235、44.981、37.247,P<0.05)。结论:DKK3基因高甲基化可促进直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭,有助于直肠癌病情及预后评估。

摘要：目的分析tRNA衍生小RNA(tsRNA)-Glu-5-0048在胃癌组织中的表达水平及其对胃癌细胞恶性生物学行为的影响。方法采用qPCR方法检测胃癌-癌旁组织和胃癌细胞系中tsRNA-Glu-5-0048的表达水平,分析tsRNA-Glu-5-0048表达水平与胃癌患者临床病理特征之间的关系。设计和合成tsRNA-Glu-5-0048的类似物和抑制剂,利用CCK-8、Transwell实验分析上、下调tsRNA-Glu-5-0048对正常胃黏膜细胞和胃癌细胞增殖能力、迁移和侵袭能力的影响。结果与癌旁组织比较,胃癌组织中tsRNA-Glu-5-0048的表达水平显著上调(P<0.05);与人正常胃黏膜细胞比较,胃癌细胞系中tsRNA-Glu-5-0048的表达水平显著升高(P<0.05);tsRNA-Glu-5-0048与胃癌分化程度、癌胚抗原及糖抗原199有相关性(均P<0.05)。在胃癌细胞中上调tsRNA-Glu-5-0048的表达后,其细胞增殖、迁移和侵袭能力也显著增强,下调则相反(均P<0.05);上、下调tsRNA-Glu-5-0048的表达对正常胃黏膜细胞无影响(P<0.05)。结论tsRNA-Glu-5-0048在胃癌中发挥促癌基因的作用,上调tsRNA-Glu-5-0048的表达可促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。