摘要：背景:雄性哺乳动物生精细胞自发性或诱发性凋亡现象与细胞凋亡相关基因有着密切的联系。spata3是一个新发现的小鼠生精细胞凋亡相关基因。目的:探讨小鼠生精细胞发育特异基因spata3的表达特性,制备高纯度的可溶性GST-SPATA3融合蛋白。设计、时间及地点:观察性实验,于2007-10/2008-08在山西医科大学生物化学与分子生物学实验室和组织学与胚胎学实验室完成。材料:pMD19-T Simple克隆载体及大肠杆菌菌株*** DH5α(TaKaRa公司),表达载体pET-41a(+)plasmid DNA(Novagen公司),大肠杆菌菌株*** BL21(DE3)(Solarbio公司);1,2,3,5,8周龄雄性和8周龄雌性BALB/c小鼠。方法:麻醉后颈椎脱臼处死小鼠,取出各小鼠的睾丸组织和8周龄小鼠的大脑、心脏、肝脏、肺、肾脏、脾脏、卵巢、子宫,提取各组织总RNA。通过聚合酶链反应、定量聚合酶链反应和原位杂交研究spata3mRNA表达及定位;通过构建原核表达载体,诱导并纯化蛋白,制备抗体。主要观察指标:①反转录-聚合酶链反应分析spata3组织特异性表达。②荧光定量聚合酶链反应分析spata3的阶段特异性表达。③spata3mRNA细胞定位的杂交信号。④SPATA3重组蛋白在原核细胞的表达及其纯化。⑤重组蛋白的Western blot分析。结果:反转录-聚合酶链反应表明spata3具有显著的睾丸组织特异性表达特征;实时定量聚合酶链反应显示spata3在精子发生后期高表达,可能与精子细胞的变态成形过程密切相关;原位杂交证明spata3转录本主要定位在圆形和长形精子细胞内,进一步提示该基因参与了精子细胞发育后期的形态变化。DNA序列测定和SDS-PAGE分析证明spata3原核表达载体构建成功并可被高效诱导表达;Western blot印迹杂交显示纯化的SPATA3重组蛋白具有高度的特异性。结论:spata3是小鼠睾丸组织特异表达的精子发生相关基因,在圆形和长形精子细胞中处于高水平转录状态;实验获得的高纯度可溶性融合蛋白完全满足后期抗体制备的需要。

摘要：目的:寻找一个最适合生精细胞体外培养的培养体系,为进一步培养人类生精细胞提供技术基础。方法:用单一酶-研磨-Percoll法制备15d龄雄性大鼠生精细胞混悬液用于体外培养。①设计两种不同的培养条件:DMEM/F12和改良人类输卵管液(HTF)作为基础培养液,分为两组。每组根据添加不同浓度的激素分为6小组。添加的睾酮(T)和FSH浓度分别为:对照组H0(T1μmol/L,FSH0IU/L)、H1组(T1μmol/L,FSH10IU/L)、H2组(T1μmol/L,FSH25IU/L)、H3组(T1μmol/L,FSH50IU/L)、H4组(T1μmol/L,FSH100IU/L)、H5组(T0μmol/L,FSH50IU/L)。②通过BRDU标记和流式细胞仪检测所有实验的生精细胞倍体的变化来判断其发育,进一步确认本研究使用培养条件的可靠性。结果:在生精细胞与支持细胞共培养过程中以改良人类输卵管液作为基础培养液,添加T1μmol/L,FSH50IU/L或100IU/L都适宜生精细胞体外培养;另通过BRDU标记及流式细胞仪检测均表明,在本研究条件下体外培养生精细胞能从初级精母细胞阶段分化到精子细胞阶段。结论:改良人类输卵管液作为基础培养液,添加浓度为50IU/L或100IU/L的FSH及T1μmol/L,最适合生精细胞的体外成熟培养。

摘要：目的探讨环磷酰胺致成年雄性小鼠睾丸生精细胞凋亡模型经人参皂苷Rg1干预后的效果。方法选择小鼠50只,经环磷酰胺造模后,分为5组:空白对照组、模型组、人参皂苷Rg1低、中、高剂量组,剂量:5、10、20 mg/kg, 10只每组。环磷酰胺造模5 d后,以人参皂苷Rg1(剂量5、10、20 mg/kg)灌胃干预,1次/d,连续2周;空白及模型对照组给予双蒸水,时间同前。在总治疗的第30天处死小鼠,依实验设计检测小鼠睾丸指数、睾丸组织形态、睾丸生精细胞凋亡、钙敏感受体(CaSR) mRNA及CaSR蛋白表达。结果空白对照组体质量、睾丸指数、睾丸质量高于模型组;给药后,人参皂苷Rg1各剂量组中的指标高于模型组(P<0.05)。空白对照组、人参皂苷各剂量组的A级、A+B级精子的百分比、总活力、浓度及总数均高于模型组(P<0.05)。人参皂苷Rg1低中高剂量组中小鼠睾丸组织中的生精细胞排列整齐有序,且数量随人参皂苷Rg1剂量增加而增加。人参皂苷Rg1干预环磷酰胺致成年雄性小鼠睾丸生精细胞凋亡后,显著逆转生精细胞内Wnt2、CaSR mRNA的表达(P<0.05)。同时,人参皂苷Rg1干预后,生精细胞内CaSR蛋白的表达也得到显著性逆转(P<0.05)。结论人参皂苷Rg1对环磷酰胺致成年雄性小鼠睾丸生精细胞凋亡具有明显保护作用,其机制可能与上调CaSR蛋白的表达有关。

摘要：目的探讨人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUMSCs)及其外泌因子对白消安(busulfan,BSF)致雄性小鼠生殖损伤的保护作用。方法将HUMSCs无血清培养48 h获得条件培养基(conditioned medium,CM),超滤浓缩为原培养基25倍。将BSF(40 mg/kg)通过腹腔注射小鼠,处理后第2天,将浓缩后的条件培养基注射至小鼠尾静脉,同时设对照组(生理盐水)、BSF组和HUMSCs组,治疗频次为每周2次,连续4周。取小鼠一侧睾丸,苏木素-伊红染色观察切片组织生精小管基底膜细胞分离情况和基底腔空泡形成情况;实时荧光定量PCR(qPCR)检测小鼠生精细胞减数分裂相关基因mRNA的表达水平;Western blot分析小鼠睾丸组织中细胞黏附相关蛋白的表达水平。结果与其他组相比,HUMSCs-CM组小鼠睾丸损伤延迟,包括生精上皮基底膜细胞形成空泡和基底膜细胞脱离;HUMSCs-CM组小鼠生精细胞减数分裂基因STRA8、TNP2、SCP3 mRNA表达水平显著增加(P<0.05),小鼠睾丸组织中N-钙黏蛋白(N-cadherin)、细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)和P-钙黏蛋白(P-cadherin)表达水平显著增加(P<0.05)。结论HUMSCs外泌因子通过减少生精细胞凋亡和增强细胞间的黏附作用保护BSF致精子发生的损害,上调黏附分子的表达。

摘要：近年对细胞凋亡的认识逐渐深入,已经开始在生殖健康领域应用。已证实在自然状态和正常生精过程中,环境因素如激素、温度、化学药物和放射线及肿瘤均可诱导生殖细胞凋亡。生精细胞凋亡受神经内分泌因素、各种理化因素、特异性基因及基因突变等许多因素的影响。根据凋亡细胞固有的形态特征,人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。

摘要：为了构建高效的靶向山羊PHGPx基因的干扰质粒,并在山羊共培养生精细胞中验证其抑制效应,利用Am-bion在线软件设计4对针对山羊PHGPx有潜在干扰效果的siRNA,体外退火后形成具有发夹结构的shRNA,将其与线性化的pGPU6/GFP/Neo载体相连形成质粒,然后经Pst I和BamH I酶切和测序鉴定;利用脂质体将其转染到体外共培养生精细胞中,用RT-PCR和Western印迹方法检测其PHGPx基因的抑制效应。结果表明:经Pst I和BamH I酶切和测序确定了150、182、214和248共4种pGPU6/GFP/Neo-PHGPx-shRNA的阳性克隆质粒;Lipo-fectamine 2000TM脂质体瞬时转染的共培养生精细胞的Real-time PCR结果表明,pGPU6/GFP/Neo-PHGPx-150、214和248质粒能够显著降低共培养细胞PHGPx mRNA的表达,蛋白免疫印迹结果图像分析免疫条带的平均光密度结果表明,pGPU6/GFP/Neo-PHGPx-214质粒极显著降低了共培养生精细胞PHGPx蛋白表达(P<0.01)。pG-PU6/GFP/Neo-PHGPx-shRNA质粒载体构建成功,pGPU6/GFP/Neo-PHGPx-214质粒瞬时转染共培养生精细胞后可以明显抑制PHGPx基因表达,可用于进一步PHGPx基因功能的研究。