摘要：目的建立甲型肝炎病毒(hepatitis A,HAV)荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测方法,用于贝类中HAV的检测。方法选择HAV高度保守的5’UTR区设计引物及探针,以HAV质粒为标准品,HAV活病毒为样本,建立HAV qRT-PCR检测方法;验证该方法的特异性、灵敏度、重复性、准确性及中间精密度;采用建立的方法检测HAV活病毒和贝类样本,并与我国贝类HAV检测国标方法(GB/T22287-2008法)进行比较。结果通过14对引物探针分别对HAV质粒(101~108拷贝/μL)检测结果的比较,选择灵敏度最优的Pan1引物,建立了HAV qRT-PCR检测方法(PAN法)。PAN法对CVA16、CVB3、EVA71、PV等11种RNA病毒均无阳性扩增;灵敏度达10 TCID50/mL;检测2.699~5.699 LgTCID50/mL各浓度HAV活病毒的回收率为82.9%~127.0%,单人和双人检测的变异系数分别为3.0%~7.0%和2.6%~8.4%。PAN法检测HAV活病毒的灵敏度(10 TCID50/mL)优于GB/T22287-2008法;两种方法对20份贝类样本的检测结果均为阴性,符合率为100%。结论建立的PAN法具有良好的特异性、灵敏度、准确性、重复性和中间精密度,可用于贝类样本中HAV的核酸定量快速检测。

摘要：目的基于荧光及可视化逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)开发食源性甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)的检测方法。方法从美国国家生物技术信息中心中选取世界范围内具有代表性的HAV基因信息,设计LAMP引物,开发了一种荧光曲线RT-LAMP和可视化RT-LAMP检测方法。以HAV质粒为模板,评估方法的扩增效率、灵敏度和稳健性,并与实时荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)进行检出限及实际样品验证比较。结果荧光及可视化LAMP方法检测灵敏度为10.76copies/μL,与实时荧光RT-PCR一致;在95%置信水平下经概率回归分析检出限(limitofdetection,LOD_(95%)),荧光曲线RT-LAMP的LOD_(95%)为17.46copies/μL(7.00~511.29 copies/μL,95%),实时荧光RT-PCR的LOD_(95%)为79.30copies/μL(24.68~3208.71copies/μL,95%);稳健性分析表明方法稳定;与实时荧光RT-PCR比较,检测30份实际样品的验证比对符合率为100%。结论该检测方法经济便捷,可通过肉眼直接观察结果,适合于食品安全现场监测,具有很好的应用前景。

摘要：目的建立甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)实时逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)快速检测方法。方法通过反应引物的筛选、检测温度的优化、灵敏度和特异性研究、模拟样品检测应用,进行甲型肝炎病毒实时RT-LAMP法检测体系建立。结果针对甲型肝炎病毒特异性基因,通过设计筛选出最佳实时RT-LAMP引物组,并使用该组引物特异、灵敏、快速地检测到甲型肝炎病毒。最佳检测温度为63℃,最小检测限为10拷贝/μL,且只对甲型肝炎病毒靶基因特异,检测应用结果可靠。结论实时RT-LAMP技术可以用于食品中甲型肝炎病毒的高效特异性检测,为食品中甲型肝炎病毒的检测工作提供更加有效的技术保障。

摘要：目的　建立一种灵敏、特异的 RT- PCR方法检测环境中的 HAV。方法　对两种 RT- PCR,即常规两步法 RT-PCR和一步法 RT- PCR检测 HAV的效果进行了观察 ,并采用半套式 PCR对扩增产物的特异性进行验证。结果　两种RT- PCR与半套式 PCR检测 HAV均得到预期条带 ,所设计的引物对其它的肠道病毒扩增呈阴性 ;在同等反应条件下 ,一步 RT- PCR的反应效率远高于常规 RT- PCR,二者的检测灵敏度也有显著性差异 ,一步 RT- PCR的检测灵敏度为 10TCID5 0 / ml,两步法 RT- PCR检测灵敏度为 10 3TCID5 0 / ml。结论　一步 RT- PCR较常规 RT- PCR易于操作 ,重复性好 ,不易污染 ,具有更高的反应效率和灵敏度。

摘要：目的建立甲型肝炎病毒(HAV)和戊型肝炎病毒(HEV)的双重荧光定量PCR检测方法并应用于临床样本的检测。方法根据参考文献分别选取HAV以及HEV基因组的保守区域设计合成特异性引物和探针,从而建立并优化双重荧光定量PCR反应体系,之后评价反应体系的特异性、敏感性和稳定性。结果本研究建立的HAV和HEV双重荧光定量PCR技术应用于检测HAV核酸时检测极限可以达到1个拷贝/反应,对同一样品重复测定5次获得的Ct值的变异系数(CV)最大为1.5%,同时该体系检测HEV的最低检测极限也达到10个拷贝/反应,重复测试5次后Ct值的变异系数(CV)最大为2.6%,临床样本测试结果显示该体系能够对甲型肝炎和戊型肝炎临床样本中的病毒进行定量。结论本研究成功建立了HAV和HEV双重荧光定量PCR检测方法,灵敏度高,稳定性好,可以同时准确定量HAV和HEV,为这两种病毒的分子病原学诊断提供了一种更加快速的手段。

摘要：目的建立基于荧光重组酶聚合酶扩增(RPA)技术的甲型肝炎病毒快速检测方法。方法设计针对甲型肝炎病毒特异性保守序列的RPA引物和探针,利用TwistAmp exo检测试剂盒建立荧光RPA扩增体系,对引物扩增效率、特异性、灵敏性进行评价。结果本研究通过设计甲型肝炎病毒异性片段的RPA引物、探针,建立了基于荧光RPA技术的甲型肝炎病毒快速检测方法。引物筛选实验表明,荧光RPA反应4 min时即可检测到起峰的曲线,扩增的目的片段长度为200 bp。特异性实验结果表明:本研究建立的RPA检测方法能够特异性地扩增甲型肝炎病毒基因组,不能扩增戊型肝炎病毒、诺如病毒、星状病毒基因组。灵敏性实验结果表明:本研究建立的RPA检测方法能够检测到低至15.6 copies/μL的甲型肝炎病毒。结论本文建立的荧光RPA检测方法特异性强、灵敏性高、稳定性好以及可操作性强,可用于对甲型肝炎病毒的检测。

摘要：以往甲型肝炎病毒（ＨＡＶ）的检测主要依赖细胞培养法，但此法所需时间长、敏感性低、特异性不强。虽然反转录ＰＣＲ等技术已被用于粪便或食品中ＨＡＶ的检测，但常规反转录ＰＣＲ操作繁琐、污染环节多，极易造成污染，致使实验结果不稳定或出现假阳性结果。为克服ＰＣＲ检测ＨＡＶ的缺点和不足，我们在实验基础上建立了一步单管反转录ＰＣＲ技术检测水中的ＨＡＶ，采用热裂解法提取样品中ＨＡＶ病毒的总ＲＮＡ，反转录与ＰＣＲ反应一步进行，整个反应在一个反应管中进行，操作方法较简单，中间可能污染的环节较少，因此，最大限度的减少了由环境造成的可能污染。我们设计合成的引物（Ｈ１—Ｈ２）在ＨＡＶ病毒核酸的ＶＰ１区，只特异地扩增ＨＡＶ核酸片断，具有较强的特异性。改进后的反转录ＰＣＲ的敏感性与常规反转录ＰＣＲ比有所提高，可检测到细胞培养悬液或水中１０个ＴＣＩＤ＿（５０）的ＨＡＶ。

摘要：目的建立能同时检测星状病毒、轮状病毒和甲型肝炎病毒的单管多重荧光定量RT-PCR方法。方法根据Gen Bank上下载的上述3种病毒基因组保守序列设计引物和探针,建立并分析多重荧光RT-PCR的重复性、特异性和敏感性;以所建立方法对128例病毒性腹泻患者粪便标本进行检测,同时以基因测序进行验证。结果所建立的多重荧光RT-PCR检测方法对轮状病毒、星状病毒和甲型肝炎病毒具有很好的特异性和重复性,轮状病毒灵敏度达到101拷贝,星状病毒和甲型肝炎病毒灵敏度达到102拷贝。128份粪便标本中,轮状病毒和星状病毒的检出率分别为17.97%和3.13%,甲型肝炎病毒未检出。与基因测序比对结果相符。结论用于轮状病毒、星状病毒和甲肝病毒的单管多重荧光定量RT-PCR方法快速、特异且灵敏,可用于临床病原诊断和流行病学调查。

摘要：Ribozyme是一类具有生物催化功能的RNA,它能定点切割RNA靶分子,从而达到有效地阻断基因表达的目的。本文依“锤头结构”原理设计合成了一个38个核苷酸的Ribozyme,能在体外定点切割甲型肝炎病毒的RNA片段(链长为123核苷酸残基,切削点对应于甲肝病毒RNA的559位)。测定了切割反应与温度、Ribozyme浓度和底物浓度的关系,其Km和kcat分别为0.63μmol/L和0.12min^(-1)。Mg^(2+)或Ca^(2+)均可作为参与该催化反应所必需的金属离子。

摘要：建立灵敏、特异、快速检测甲型肝炎活病毒(HAV)的方法。提取HAV总RNA,选用HAV高保守区为目标区,设计合成一对引物,通过RT-PCR反应扩增其核酸,用琼脂糖凝胶电泳法检测其扩增产物,紫外灯下观察,约200bp处为目标片段,根据观察结果,计算HAV滴度。RT-PCR一步法快速、灵敏、重复性好、特异性强,可用于甲型肝炎活病毒检测。