摘要：目的建立基于疟原虫无性期(A期)18S rDNA检测感染人的5种疟原虫的qPCR,并评价其检测效果。方法从GenBank中下载5种疟原虫A期、子饱子期(S期)、卵囊期(O期)和人的18S rDNA序列进行比对,划分保守区和变异区,在保守区设计疟原虫属特异性引物,在变异区设计种特异性引物。以5种疟原虫DNA、田鼠巴贝虫和婴儿利什曼原虫DNA为模板进行qPCR扩增,筛选特异性引物对。应用qPCR法筛选特异性引物对的最佳退火延伸温度和引物浓度。分别构建5种原虫A期18S rDNA短片段(筛选出的引物对扩增产物)和长片段(属特异性引物扩增产物)质粒,以连续浓度梯度的短片段质粒DNA[(5×10^(1))~(5×10^(8))拷贝/μl]、长片段质粒DNA[(5×10^(4))~(5×10^(9))拷贝/μl]为模板分别进行qPCR扩增,测定筛选出的引物对的扩增效率、最低检出限[包括最低质粒浓度、循环数阈值(Ct值)、变异系数]、无扩增时非目标DNA的最高浓度、可检出的混合DNA中不同虫种间的最大拷贝浓度比值。以5倍稀释的18份疟原虫血样DNA[恶性疟原虫(Pf)6份、间日疟原虫(Pv)6份、卵形疟原虫(Po)4份、三日疟原虫(Pm)2份、诺氏疟原虫(Pk)1份]为模板,应用筛选出的特异性引物分别进行qPCR、一步反转录qPCR和巢式PCR扩增,计算最低检出限时的原虫密度。用筛选出的特异性引物进行应用验证,对70份疟疾患者血样DNA(Pf 26份、Pv 14份、Pm 14份、Po 9份、Pk 3份、混合感染4份)、65份疟原虫阴性人血样DNA以及阿米巴(1份)、田鼠巴贝虫(1份)和杜氏利什曼原虫DNA(3份)进行qPCR扩增,以样品提供者的检测结果为标准,计算qPCR检测的敏感度、特异度、符合率。不同PCR方法检测结果的比较采用卡方检验、t检验、Mann-Whitney检验或Wilcoxon秩和检验。结果序列比对结果显示,5种疟原虫A期18S rDNA序列的一致性为89.3%~96.7%,高于S期的60.0%~92.1%,可分为9个保守区和8个变异区。除Pv O期和Pm S期18S rDNA外,保守区序列长度相同,一致性≥92%。筛选获得1对属特异性引物和5对种特异性引物,各引物对的qPCR扩增效率为90.6%~98.8%,qPCR扩增的最佳退火延伸温度为57.8℃,最佳引物终浓度为0.3μmol/L。6对特异性引物的qPCR检出的最低质粒浓度均为5×102拷贝/μl,对应Ct值为32.3~33.1,变异系数为0.5%~3.7%。5对种特异性引物qPCR扩增非目标DNA结果均为阴性时非目标DNA的最高浓度为(5×10^(6))~(5×10^(8))拷贝/μl,可检出的混合质粒中不同虫种间的最大拷贝浓度比值均为104。一步反转录qPCR、qPCR和巢式PCR可检出的最低原虫密度平均值分别为(4.1±5.1)、(6.0±4.3)和(8.2±2.9)虫/μl血,最低值分别为0.01、0.3和2.0虫/μl血,变异系数分别为125.6%、72.2%和35.8%,一步反转录qPCR检出最低原虫密度的敏感性高于另两种方法(Wilcoxon秩和检验,Z=-2.0、-2.0,均P0.05)。应用验证结果显示,qPCR的敏感度和特异度均为98.6%,qPCR检测结果与标准结果的符合率为98.6%,差异无统计学意义(χ^(2)=0.0,P>0.05)。结论建立了基于疟原虫A期18S rDNA的qPCR检测系统,可用于鉴定常规疟疾血样。

摘要：目的 建立一种重组酶介导等温扩增技术(RAA)检测疟原虫的方法。方法 针对疟原虫属保守18S小亚基核糖体RNA(18S rRNA)基因设计特异性引物,筛选确定最佳引物对组合并建立疟原虫重组酶介导核酸等温扩增体系。通过该RAA体系检测疟原虫标准质粒、4种疟原虫[恶性疟原虫(Plasmodium falciparum, P.f)、间日疟原虫(P. vivax,P.v)、三日疟原虫(P. malaria, P.m)、卵形疟原虫(P. ovale, Po)]病原体以及其他6种输血传播寄生虫(婴儿利士曼原虫、杜氏利士曼原虫、刚地弓形虫、溶组织阿米巴虫、犬吉氏巴贝西虫、田鼠巴贝虫),以评估该体系的灵敏度和特异度。结果 筛选出一组扩增效果较好的引物对,整个RAA体系使用最佳引物对在37℃,20 min即可完成扩增,对标准质粒的检测下限为10-2copies/μL,恶性疟原虫、间日疟原虫和卵形疟原虫为102copies/μL,三日疟原虫为10 copies/μL。RAA检测体系未与其他输血传播寄生虫产生交叉反应,特异性良好。应用RAA方法检测外籍学生献血者标本,结果与荧光定量PCR结果一致。结论 成功建立了一种快速、简便和特异的疟原虫RAA检测方法,将会给血液筛查和一些基层偏远医院的临床检测提供很大帮助。

摘要：目的建立一种疟原虫雌性配子体的分子检测法。方法根据疟原虫雌性配子体特异性mRNA靶标(待测靶序列)即动合子表面蛋白(s25)的转录产物,设计特异性的捕获探针和连接探针。血液样品经裂解释放的mRNAs,无需核酸提取,通过“三明治”杂交被捕获到96孔板表面。洗去未结合探针后,将结合在mRNA靶标上的连接探针进行连接,得到两端为特殊设计序列的单链扩增模板。再用通用引物进行染料法qPCR扩增,或在端部设计TaqMan探针序列,用通用引物和通用TaqMan探针进行探针法qPCR扩增。评价这一基于捕获和连接扩增的方法(CLIP-PCR)的灵敏度、特异性和重复性并与普通的RT-qPCR方法进行比较,将其应用于临床样品的检测。结果该CLIP-PCR具有较高的灵敏度和特异性。与普通的RT-qPCR一样,均可检测低至11拷贝数的s25 mRNA靶标;而且该CLIP-PCR操作更简便。该CLIP-PCR可准确检测到疟疾患者血液中的雌性配子体。可将96个样品的检测时间缩短至3 h。结论建立了灵敏高效的染料法和通用TaqMan探针法CLIP-PCR检测疟原虫雌性配子体,为疟疾传播的控制、配子体大规模筛查奠定了基础。

摘要：目的 建立一种能检测4种疟原虫多重qPCR(multiplex quantitative real-time polymerase chain reaction)方法,并对其进行临床应用评价。方法 以4种疟原虫18S rRNA基因作为靶序列,在保守区域设计双侧扩增引物,根据4种疟原虫特异性区域分别设计荧光探针,建立多重qPCR检测方法,并测试其特异性、敏感性,同时应用该方法对疟疾或疑似疟疾的临床血样进行检测。结果 建立检测4种疟原虫多重qPCR方法具有良好的特异性与敏感性,检测下限可达10拷贝/μl。该方法对浙江省2020年—2021年115份疟疾或疑似疟疾的临床血样进行检测,结果与疟疾分子诊断参考方法巢式PCR一致,临床特异度与敏感度均为100%。结论 本研究所建立的检测4种疟原虫多重qPCR方法简单快速、特异性好、敏感性高,可应用于疟疾临床病原诊断和参比实验室样本复核。

摘要：成簇规律间隔短回文重复序列/Cas关联蛋白9(CRISPR/Cas9)系统改造的基因编辑技术是继锌指核酸酶基因编辑技术和类转录激活因子效应物编辑技术后迅速发展起来的第3代基因编辑技术^([1])。CRISPR/Cas9系统具有操作设计简单,突变效率高,成本低廉等优点,迅速超越以往技术,成为当前最热门的定点基因编辑工具。CRISPR/Cas9基因编辑技术已经在多种动植物细胞中成功应用,包括哺乳动物类甚至人类的细胞。

摘要：按照《体外诊断试剂注册与备案管理办法》,对英科新创(厦门)科技股份有限公司研发生产的恶性疟原虫/间日疟原虫抗原检测试剂盒(胶体金法)进行临床考核,共考核临床静脉全血样本1 100份,结果表明,试验产品能够达到与已上市同类对照检测方法的检测效能,考核试剂50例样本的静脉全血与指尖血对比检测结果一致,符合临床人体静脉全血或指尖血样本的中恶性疟原虫抗原或间日疟原虫抗原的检测。

摘要：目的　在毕赤酵母表达系统中获得大量构象正确的 3D7/MSP1 4 2重组蛋白进行疫苗有效性试验。方法　采用不对称PCR法拼接合成了 3D7/msp1 4 2基因 (12 0 2bp) ,用电穿孔法将合成基因导入毕赤酵母并进行诱导表达 ,用免疫印迹法检测表达产物。结果　按毕赤酵母密码子使用频率重新设计并全合成了 3D7/msp1 4 2基因序列 ,该合成基因在毕赤酵母系统 (Pichiapastoris)中得到高水平分泌表达 ,产生全长重组蛋白。识别构象表位的特异性单克隆抗体能与该重组蛋白反应。结论　重新设计的基因能在毕赤酵母中高水平分泌表达 ,并产生构象正确的重组蛋白 。

摘要：目的为了解非洲输入性卵形疟原虫的二态性,对杭州市确诊的卵形疟病例感染疟原虫的k13基因多态性进行了分析。方法收集2014年2月—2021年6月杭州市诊断、报告的卵形疟现症病例血样22份,根据流行病学确认虫株感染地。提取疟原虫DNA,巢式PCR扩增、测序卵形疟原虫k13基因螺旋浆区206 aa~725 aa的编码区。测序序列与参比序列比对、整理获得cDNA序列,分析cDNA序列的单倍体类型和突变位点。结果卵形疟现症病例血样22份,90.9%(20/22)扩增到卵形疟原虫k13基因224 aa~725 aa编码区的DNA,测序、整理获得cDNA序列16条,存在3种单倍型,Curtisi单倍型、Wallikeri单倍型、突变型的占比分别为31.2%(5/16)、62.5%(10/16)和6.3%(1/16)。Curtisi型与Wallikeri型的序列之间存在c.711等38个碱基替换位点,突变型序列较之Wallikeri型,在c.1998位点出现T>A的同义突变。结论非洲输入杭州的卵形疟原虫以Wallikeri型为主,且突变型与Wallikeri型同源性更高。

摘要：目的建立高效的疟原虫种属特异性检测方法。方法设计疟原虫种(核糖体18S rRNA,4对)和属(线粒体基因,1对)特异性引物,与通用引物(5′-CGAGTCCTGCGGTCTCAAATT-3′)连接后,形成5对嵌合特异性引物。常规PCR确定各对引物的最佳退火温度和引物浓度,多重PCR优化5对引物混合后的最佳反应条件,建立反应体系(命名为P5-mPCR方法)。用P5-mPCR检测不同原虫密度的间日疟原虫(Pv)、三日疟原虫(Pm)、卵形疟原虫(Po)、恶性疟原虫(Pf)感染者血样和模拟混合感染样品,确定P5-mPCR方法的检测灵敏度。用日本血吸虫、刚地弓形虫、杜氏利什曼原虫、猪囊尾蚴、卫氏并殖吸虫、隐孢子虫等其他寄生虫感染者血样或虫体DNA评价P5-mPCR方法的特异性。用212份疟疾送检血样,与巢式PCR方法比较评价其应用价值。结果优化后的P5-mPCR反应体系各组分含量(体积比)为:DNA模板10%、引物Mix 5%、dd H_2O 35%,Taq酶预混液50%。反应体系的最佳循环条件为:95℃ 5 min;94℃ 15 s,58℃ 20 s,72℃ 20 s,循环5次;94℃ 15 s,62℃ 20 s,72℃ 20 s,循环10次;94℃ 15 s,68℃ 20 s,72℃ 20 s,循环25次;72℃ 3 min;10℃ 5 min。扩增产物的长度分别为:Pv 778 bp,Pm 582 bp,Po 400 bp,Pf 256 bp,疟原虫属334 bp。其检测灵敏度分别为4.49、5.45、6.39、4.07个虫/μl血(种特异性检测平均值为4.85个虫/μl血)和0.10~1.07个虫/μl血(属特异性检测的平均值为0.41个虫/μl血)。P5-mPCR检测含有50~200个虫/μl血的模拟混合样品,各特异性扩增条带均清晰可见;检测日本血吸虫、刚地弓形虫、杜氏利什曼原虫、猪囊尾蚴、卫氏并殖吸虫、隐孢子虫等其他寄生虫样品,结果均为阴性。巢式PCR和P5-mPCR检测212份疟疾送检血样,两种方法检测结果的一致性较高(Kappa=0.866,P<0.01),检出的阳性率分别为75.0%(159/212)和79.7%(169/212),差异具有统计学意义(χ~2=8.100,P<0.01)。从分型诊断来看,两者的差异主要来源于Pf(P<0.01)和Po(P<0.05)样品,对Pv、Pm和混合感染血样的检测结果,两种方法差异无统计学意义。结论建立的P5-mPCR方法具有敏感性高,特异性好,操作简便快速,检测结果易于判断,一次反应即可确定4种人体疟原虫。

摘要：目的采用环介导等温扩增(LAMP)方法检测疟原虫DNA,并评价其检测效果。方法采集2013-2018年从疟疾流行区回国人员中确诊为疟疾患者的滤纸血样。根据疟原虫的18S r RNA序列,使用PrimerExplorer V5软件设计恶性疟原虫与非恶性疟原虫LAMP引物,建立疟原虫LAMP检测方法,进行敏感性、特异性、灵敏度和扩增效率评价,并与巢式PCR比较。检测钙黄绿素指示剂对LAMP反应的影响。结果LAMP和巢式PCR各检测96份疟疾患者血样(47份恶性疟血样和49份其他疟疾血样),均检出93份疟原虫阳性。LAMP检测结果显示,恶性疟血样均被检出,非恶性疟假阴性率为2.1%, 10份利什曼原虫玻片血、8份日本血吸虫感染兔血和38份健康人血均为阴性,与巢式PCR检测结果具有极高的一致性(Kappa值=0.956)。LAMP检测恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫的灵敏度分别为25、3、4、2个疟原虫/μl血。扩增效率检测结果显示,4种疟原虫LAMP反应出现浊度时间(Tt值)均小于60 min,速率曲线峰值(Df)达0.14以上,其中恶性疟原虫扩增效率较高,Tt值为20.4 min, Df达0.16。可视化LAMP检测结果显示,钙黄绿素指示剂对不同种疟原虫LAMP反应延时约8~22 min, Df下降约21%~35%。结论 LAMP技术检测疟原虫有高度敏感性、特异性和灵敏度,且可视,具有在现场及基层医疗机构应用前景。