摘要：目的通过建立RNA干扰(RNAinterference,RNAi)抑制XJ160病毒复制的模型,在序列特异性、位置效应和量效关系等方面,探讨RNAi对XJ160病毒复制的影响,为进一步研究RNAi的抗病毒作用和机制奠定基础。方法按照siRNA(shortinterferencingRNA)的设计要求合成XJ160病毒特异siRNA,脂质体法转染BHK21细胞后感染XJ160病毒,通过测定病毒滴度、蛋白表达量及XJ160病毒RNA合成研究siRNA对XJ160病毒复制的抑制。结果成功建立了RNAi抑制XJ160病毒复制的模型,探讨了RNAi抑制该病毒复制作用的特点。结论外源导入的siRNA能够抑制XJ160病毒的复制,并且这种抑制作用具有明显的序列特异性、位置效应和存在量效关系等特点;siRNA是通过降解病毒RNA实现抑制病毒复制作用的。

摘要：目的　探讨HBV核心启动子nt176 2～ 176 4突变与肝病严重性的关系以及对e系统状态和病毒复制的影响。方法　采用半套式突变特异PCR (msPCR)技术检测 97例各型肝病患者血清nt 176 2～ 176 4突变株的感染状况。结果　经测序和扩增产物电泳证实 ,采用我们设计的引物建立的msPCR方法检测HBV感染者血清nt 176 2～ 176 4突变株和野生株的特异性强 ,方法可靠。急性肝炎、慢性肝炎轻度、中度、重度及肝硬化患者nt176 2～ 176 4突变株感染比例分别为 2 5、7 4 3、10 31、1 3和7 15 ,肝硬化患者nt 176 2～ 176 4突变株感染率显著高于慢性肝炎轻度患者 (P <0 .0 2 5 )。在 92例慢性HBV感染者中 ,野生株 (2 5 92 )、突变株 (42 92 )和混合感染者 (2 5 92 )血清HBeAg阳性率分别为80.0 %、5 6 0 %和 6 4.3% ;HBVDNA含量分别为 (4.4± 8.5 )× 10.8、(1.1± 1.36 )× 10.9和 (1.4± 1.8)× 10.9拷贝 ml;ALT异常率分别为 4 4.0 %、5 2.0 %和 4 2.6 % ;ALT水平分别为 (5 8.6± 79.0 )、(5 7.1± 75.2 )和(6 2 .6± 90.3)IU L ,以上各组之间比较差异无统计学意义。结论　msPCR技术检测nt176 2～ 176 4突变灵敏特异。nt176 2～ 176 4突变与肝病严重性有密切关系 ,这种相关性与突变株的e系统状态、高病毒复制无任何关?

摘要：目的　在细胞水平上 ,利用研制的SARS病毒全基因组芯片技术探讨人重组干扰素α2b抑制SARS病毒复制的分子机制。方法　根据已经发表的SARS病毒基因组全序列和生物信息学软件分析 ,设计包括SARS病毒全基因组的各个可能编码区的PCR引物 ;将所有PCR产物用来制备SARS病毒的全基因组cDNA芯片。利用该芯片来探讨人重组干扰素α2b抑制SARS病毒复制的分子基础。结果　通过PCR方法研制了SARS病毒全基因组的cDNA芯片 ,并说明cDNA芯片可以准确地检测SARS病毒各个基因的RNA水平。利用这一技术研究了干扰素抗SARS病毒的分子机制。结果表明 ,人重组干扰素α2b可以明显抑制SARS病毒复制过程中几乎所有病毒RNAs的转录 ,并呈现一定的剂量关系 ;并发现一个目前还没有确定功能的SARS病毒新基因 ,命名为U基因 ,转录最早 ,转录水平最高 ,对干扰素的抑制作用也很敏感 ;它可能在病毒的转录复制过程中发挥重要作用。结论　SARS冠状病毒cDNA芯片可以用来研究病毒复制的分子机制以及相关抗病毒药物包括干扰素的研究。本文在分子水平上研究了人干扰素α2b抑制SARS病毒复制的基因转录动态 。

摘要：RNA干扰(RNAi)技术作为一种特异性地抑制哺乳类细胞外源性或内源性基因表达的方法,近年来在口蹄疫病毒(FMDV)防治研究中迅速发展起来。文章综述了利用RNAi技术抑制口蹄疫病毒复制的各种策略,包括化学合成或病毒载体转染构建抑制FMDV复制的小干扰RNA(siRNA)、构建多个FMDV功能区的SiRNA、交叉抑制不同血清型FMDV的siRNA的设计和双功能载体来双向防控FMDV的SiR-NA设计。RNAi干扰技术的发展,为设计防治口蹄疫新型疫苗奠定了基础。

摘要：利用Red重组系统和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bacmid在*** DH10Bac中快速敲除BmNPV极晚期表达因子基因vlf-1,调查对病毒复制的影响,以探究BmNPV vlf-1基因的功能。首先从*** BW25113中提取能表达Red重组酶的质粒pKD46,将其转化到*** DH10Bac中,获得可用于BmNPV基因打靶的DH10Bac(含有质粒pKD46)菌株;再为发生基因同源重组设计一对长60 bp的引物,5'端长40 bp,分别为vlf-1基因的左右同源臂,3'端长20 bp,分别为氯霉素抗性基因(cat)的首尾序列;以含有cat的pKD3质粒为模板,PCR扩增含vlf-1同源臂的cat基因,即打靶线性化片段;将该线性化片段转入DH10Bac(pKD46)菌株,在Red重组酶的作用下,线性化片段与Bacmid DNA中的vlf-1基因发生同源重组。利用设计的2对特异性引物PCR验证cat基因替换vlf-1基因操作成功,获得vlf-1缺失型BmNPV。将vlf-1缺失型Bacmid DNA转染BmN细胞,利用qPCR分析vlf-1基因缺失对于病毒复制的影响,结果表明:vlf-1基因缺失对BmNPV起始DNA复制没有明显的影响,但是可能影响之后的病毒装配和侵染。

摘要：根据siRNA设计原则,选取了PRRSV N基因上的保守序列作为可能的干扰位点,设计、合成了3个siRNAs,分别将其克隆到pSIREN-Shuttle中,获得3个siRNA重组表达质粒:pShuttle-N1,pShuttle-N2和pShuttle-N3。将siRNA重组表达质粒与融合表达质粒pEGFP-ORF7共转染Marc145细胞,并通过荧光显微镜观察。结果显示,siRNA重组表达质粒能显著抑制PRRSV N基因的表达。在转染总剂量(0.7μg/孔)固定的条件下,分别将不同组合的siRNA表达质粒共转染Marc145细胞,各组合转染孔对PRRSV复制的抑制作用没有明显差异,其中3种siRNA表达质粒共转染对PRRSV复制的抑制最好,证实siRNA对病毒复制作用具有相加性。

摘要：为探究猪肺泡巨噬细胞(PAM)极化与猪瘟病毒(CSFV)复制之间的关系,本研究首先通过支气管肺泡灌洗液法建立了高纯度原代肺泡巨噬细胞的培养体系。通过western blot确立了PAM向M1和M2型巨噬细胞极化的鉴别体系,并用CCK8法检测巨噬细胞极化后的细胞活性。在此基础上,通过间接免疫荧光试验和荧光定量PCR分别检测感染不同亚型PAM的CSFV E2蛋白的表达及其E2基因的转录水平,显示PAM向M1型的极化可减少CSFV E2蛋白的表达,从而抑制病毒的复制。本研究不仅为研究宿主对CSFV的免疫机制提供了重要线索,而且为设计基于巨噬细胞极化亚型防制CSF新策略提供一定依据。

摘要：【目的】探明鸡源环指蛋白165(ring finger protein 165,RNF165)在A亚群禽白血病病毒(ALV-A)复制中的作用,为进一步研究鸡源RNF165对ALV-A致病性的影响提供参考。【方法】将ALV-A接种于DF-1细胞和1日龄雏鸡,通过Western blotting和实时荧光定量PCR方法分别从体外和体内两个方面验证ALV-A对宿主RNF165表达的影响;参考已公布的RNF165基因序列设计过表达引物,通过PCR扩增RNF165基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1;将验证表达的重组质粒转染DF-1细胞,1 d后接种ALV-A,使用Western blotting检测过表达RNF165对病毒复制的影响;最后设计突变引物,构建RNF165功能结构域突变质粒,将过表达质粒和突变质粒分别转染DF-1细胞,1 d后接种ALV-A,Western blotting测定gp85蛋白表达差异。【结果】ALV-A感染DF-1细胞后未能检测到内源性的RNF165蛋白,但基因转录水平较对照组明显下调(P<0.01)。在体内试验中,与对照组相比,感染病毒雏鸡肝脏中RNF165基因和蛋白表达水平均有所下调(P<0.01);通过PCR成功扩增到大小为1068 bp的目的片段并成功克隆至pcDNA3.1,Western blotting结果显示,在39 ku处出现目的条带,RNF165过表达后促进了病毒复制;测序结果显示,成功构建出功能结构域突变质粒,与过表达质粒组相比,RNF165突变质粒组病毒的复制水平受到显著抑制。【结论】ALV-A感染抑制DF-1细胞和雏鸡肝脏RNF165的表达,在体外试验中,过表达RNF165会促进ALV-A的复制,且这种影响与其保守结构域有关。

摘要：目的　探讨反基因及反义寡核苷酸抗乙型肝炎病毒(HBV) 作用。方法　设计合成针对HBV 核心启动子Sp1 位点(1734 nt～1754 nt)及前CRNA、前基因组RNA5′端起始区(1814 nt～1834 nt) 的21 聚硫代修饰反基因寡核苷酸(ODNan21)及反义寡核苷酸(ODNas21) 。将各寡核苷酸与22 .1 .5 细胞温育。采用酶联免疫吸附法(ELISA) 及斑点杂交法分别检测经处理的22.1 .5 细胞培养上清HBsAg、HBeAg 及HBV DNA 水平。结果　ODNan21 、ODNas21 处理的22 .1 .5 细胞HBsAg、HBeAg 水平明显低于对照组( P< 0 .001)。浓度为10 μmol/L 时,ODNan21,ODNas21 对HBsAg、HBeAg 的抑制分别达57.% 、77 % ;61% 、79 .6 % ;两者联合给药的抑制达71 .5% 、85 % 。该抑制呈剂量依赖性并于给药后48 小时达高峰。ODNan21 、ODNas21 处理的22 .1.5 细胞HBVDNA 水平低于对照组。无关序列对照寡核苷酸对HBVDNA 及抗原合成无明显影响。在实验范围内,寡核苷酸对22 .1 .5 细胞无毒性作用。结论　ODNan21、ODNas21 在体外能有效抑制HBV 复制及抗原合成。

摘要：干扰素诱导蛋白44(IFI44)作为Ⅰ型干扰素(IFN)家族成员之一,在IFN依赖的抗病毒应答过程中发挥重要作用。前期研究表明,水疱性口炎病毒(VSV)感染可诱导宿主细胞IFI44显著上调。为进一步明确IFI44因子在VSV感染过程中的作用,本研究分别设计、构建IFI44基因沉默和过表达载体,将其作为穿梭质粒与慢病毒骨架质粒共转染293T细胞,成功包装出表达shIFI44及IFI44基因的慢病毒颗粒。在此基础上,将表达shIFI44及IFI44基因的慢病毒分别感染RAW264.7小鼠巨噬细胞,经嘌呤霉素筛选后建立相应细胞系。以VSV分别感染上述2种细胞系,通过荧光定量PCR法及TCID50法检测病毒的复制水平。上述研究结果表明,IFI44对VSV在宿主细胞中的复制增殖具有明显的促进作用。该研究结果不仅有助于揭示VSV致病的分子机制,而且为水疱性口炎(VS)疫病的防控提供新的思路。