摘要：目的快速、准确检测食品中的痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)感染。方法针对痢疾志贺菌的侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)设计引物,通过对PCR扩增体系中dNTP浓度、Mg2+浓度、引物浓度、酶用量、退火温度和循环数进行优化,建立痢疾志贺菌PCR快速检测方法,并对其特异性、敏感性进行分析。结果该方法检测的特异性好,痢疾志贺菌纯培养物和基因组DNA的灵敏度分别为1.06×102cfu/ml和106.34pg/PCR反应体系;直接检测模拟食品中的痢疾志贺菌,其检出限为3.21×104cfu/ml。结论该方法操作简单、检验周期短、特异性和灵敏度高,适用于快速、准确检测食品中致病菌的污染。

摘要：目的对环境水体中痢疾志贺菌荧光定量PCR检测方法进行研究和评价。方法根据痢疾志贺菌侵袭性质粒抗原H(invasion plasmid antigen H,ipa H)基因设计引物,利用普通PCR方法扩增其ipa H基因并将其与T载体进行连接以获得ipa H-T重组质粒;对重组质粒进行梯度稀释后进行荧光定量PCR,观察其标准曲线及最低检出限;提取17株可在环境水样中存在的多种致病菌DNA并以同样反应体系进行荧光定量PCR,验证该方法的特异性;将痢疾志贺菌加标于地表水水样中,测试该方法的环境样品检测能力。结果成功扩增痢疾志贺菌ipa H基因并连接T载体;通过荧光定量PCR检测各梯度浓度重组质粒的Ct值间隔相近,检出限低至10 copies;17株致病菌DNA的检测结果均为阴性,显示该方特异性好;在环境地表水菌落总数为3.5×103 CFU/ml、痢疾志贺菌加标浓度低至5 CFU/ml时,仍可以通过该方法检出,显示该方法的抗干扰能力强,可用于环境水样的直接检测。结论通过荧光定量PCR方法可实现对水中痢疾志贺菌进行快速检测,检测时限3 h以内,检测浓度5 CFU/ml,特异性及抗干扰性好,可用于污染水样的快速直接检测。

摘要：目的建立活的非可培养（viable but noncuhurable state，VBNC）状态痢疾志贺菌逆转录荧光定量PCR（reverse transcription quantitative PCR，RT—qPCR）检测方法。方法低温寡营养诱导痢疾志贺菌进入VBNC状态，用平板计数法和荧光显微镜检法确定细菌的可培养数和活菌数，以痢疾志贺菌的志贺毒素基因stx（GenBank：M19437）、侵袭性毒力基因ipaH（GenBank：NC_007607）为目的基因设计引物，提取RNA进行RT—qPCR检测，研究检出限并建立标准曲线，用加标于环境水体中的志贺菌水样进行方法验证。结果建立处于VBNC状态的痢疾志贺菌RT—qPCR检测技术，检测时间少于6h，复杂环境水体中每500恤l水样可培养的痢疾志贺菌检出限为1—5cfu，VBNC状态的痢疾志贺菌3～25cfu。结论该方法检测快速，可实现对VBNC状态志贺菌的检测，可用于复杂水样的直接检测，适用于水体污染调查和应急反应时快速筛查志贺菌。

摘要：目的建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测痢疾志贺菌,并对其特异性、灵敏度与传统PCR进行比较。方法以痢疾志贺菌侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)为靶序列,设计6条特异性引物(内引物、外引物和环引物各2条),优化LAMP反应体系及反应条件,检测LAMP反应的灵敏度、特异性及模拟样品,同步与PCR进行比较。结果 LAMP法和PCR均能特异性地扩增出志贺菌靶DNA,而其他非志贺菌均未扩增出特有条带。检测细菌纯培养物和模拟食品的灵敏度LAMP法分别为5.3×101cfu/ml、6.8×101cfu/ml,PCR法分别为5.3×102cfu/ml和6.8×102cfu/ml。结论利用LAMP技术,可快速、灵敏、简便地检测痢疾志贺菌,与PCR方法比较,特异性强、操作简便、检测成本低、耗时短,有望发展成为快速检测痢疾志贺菌的有效手段。

摘要：目的:建立一种痢疾志贺菌、沙门菌和单增李斯特菌的多重PCR诊断方法。方法:根据伤寒沙门菌VipR基因、痢疾杆菌侵袭性质粒抗原H(ipaH)基因和单增李斯特菌溶血素hlyA基因序列作为目的基因片段痢疾志贺菌、沙门菌和单增李斯特菌的特异性抗原基因序列,分别设计一对引物,优化各种工作条件,建立一种多重PCR诊断方法。结果:本法特异性好,敏感性可达104拷贝,整个实验过程在3 h～5 h内完成。结论:建立的方法在理论和实际应用上都有优越性,且一次可检测出三种病原菌,可用于临床诊断。