摘要：目的构建表达人类白细胞抗原-G（HLA—G）基凶shRNA载体，探讨其对自然杀伤细胞（NK）细胞杀伤效应的影响。方法构建4个HLA—G—shRNA真核表达质粒，转染至Huh7细胞。检测HLA—GmRNA及蛋白质水平的表达。将NK-92MI细胞与靶细胞共同培养，以LDH释放法观察不同效靶比时NK-92MI细胞对靶细胞的杀伤效应。结果经酶切及测序鉴定证实，插入序列与设计的序列相符。RealTime—PCR和Western-blot结果均表明重组载体抑制了Huh7细胞HLA-G基因的表达。NK-92MI细胞对转染HLA—G的shRNA的Huh7细胞杀伤作用明显升高（P〈0．01）。封闭NK-92MI细胞ILT2受体后，杀伤作用降低（P〈0．01）。结论HLA—GshRNA可以增强NK细胞对肝癌细胞的杀伤效应。

摘要：目的利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除小鼠源肝癌细胞H22中的GP73基因,构建H22细胞GP73基因敲除的稳定细胞株。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计2条特异性识别GP73基因启动子的上下游sgRNA,利用载体p X459质粒,构建2对重组真核表达质粒。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转染至H22细胞内,使用嘌罗霉素加压筛选稳定敲除GP73的H22细胞株,利用免疫印迹检测重组质粒对内源GP73的敲除效果。MTT实验检测GP73被敲除后对细胞增殖能力的影响,再利用划痕实验检测细胞的迁移能力。结果免疫印迹结果说明敲除GP73基因的小鼠源H22细胞株内无GP73蛋白的表达;并且GP73被敲除后,H22细胞的增殖能力和迁移能力减慢。结论通过CRISPR/Cas9系统获得了靶向GP73基因的重组质粒,并且筛选出了稳定干扰GP73表达的细胞株,从而为探讨GP73在肝癌发生中的作用奠定基础。

摘要：目的观察作用于环氧合酶2(COX-2)mRNA的发卡状COX-2(COX-2 shRNA)真核表达质粒对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响。方法设计靶向COX-2基因的RNA干扰序列,构建COX-2 shRNA表达载体,用阳离子脂质体Lipofectamine 2000转染体外培养的HepG2细胞。半定量RT-PCR检测COX-2 mRNA表达水平的变化,筛选有效抑制COX-2基因表达的序列。采用CCK-8细胞计数法检测COX-2 shRNA对细胞增殖的影响,流式细胞仪测定细胞凋亡率和细胞周期,Western blotting检测细胞内COX-2和Bcl-2蛋白表达水平。结果测序结果显示成功构建了2个表达COX-2 shRNA的质粒载体,转染HepG2细胞后COX-2 mRNA表达下降至阴性对照组的41.66%和77.79%。选择沉默效率较佳者转染细胞并经G418筛选,获得稳定表达COX-2 shRNA的细胞,胞内COX-2 mRNA表达水平下降了75.30%,细胞增殖活性下降了29.33%。在稳定表达COX-2 shRNA、错义序列以及未转染的细胞中,细胞凋亡率分别为17.83%、4.63%和4.47%,G0/G1期细胞比例分别为73.93%、61.2%和57.630%,而S期细胞比例分别为13.43%、26.03%和26.90%。Western blotting检测显示,表达COX-2 shRNA的HepG2细胞内COX-2蛋白水平下降至表达错义序列组的31.25%(P<0.01),Bcl-2蛋白水平下降至表达错义序列组的54.93%(P<0.01),而转染错义质粒组与未转染组之间比较差异无统计学意义。结论构建的真核表达载体pSilencer 2.1-U6-COX-2 shRNA能有效沉默人肝癌HepG2细胞内COX-2基因的表达,并具有抑制细胞增殖、促进细胞凋亡和细胞周期阻滞、降低胞内抗凋亡蛋白Bcl-2水平的作用。

摘要：目的观察膜孔相互作用分子1（Stiml）基因表达下调对肝细胞癌（HCC）细胞凋亡的作用。方法设计和合成Stiml基因干扰序列，构建慢病毒介导的RNA干扰载体，利用第3代慢病毒包装系统进行病毒制备；干扰慢病毒以2倍感染复数（MOI）感染SMMC7721细胞，定量聚合酶链反应（PCR）和免疫印迹法（WB）检测Stiml基因表达；采用碘化丙锭（PI）和膜联蛋白V（AnnexinV）双染法检测SMMC7721细胞的凋亡变化。结果测序结果表明干扰序列连入干扰载体；定量PCR和Westernblot法检测结果显示干扰慢病毒感染可以抑制Stiml基因75％以上的表达；流式细胞仪检测结果表明在Stiml基因被敲减后，凋亡细胞的比例从8％上升到26％。结论Stiml基因的敲减促进SMMC7721细胞的凋亡。

摘要：目的构建果糖-1,6-二磷酸酶1(FBP1)重组腺病毒,并探究FBP1对肝癌细胞(HepG2)自噬及增殖的影响。方法PCR扩增FBP1cDNA序列并克隆到腺病毒载体pAdTrack-TO4,构建重组腺病毒质粒pAdTrack-FBP1,将重组腺病毒质粒用Lipofectamine3000转染至HEK293细胞中,包装、扩增获得高滴度重组腺病毒AdFBP1。用重组腺病毒AdFBP1感染HepG2细胞,同时设置Mock组和AdGFP组。通过Westernblot技术和激光共聚焦技术观察FBP1对肝癌细胞自噬水平的影响,进一步通过克隆形成实验和MTS实验观察FBP1对肝癌细胞增殖能力的影响。组间均数比较采用t检验、单因素方差分析。结果成功构建高滴度重组腺病毒FBP1。Westernblot和激光共聚焦检测结果显示,与AdGFP组相比,AdFBP1组自噬水平明显降低。Westernblot结果表明,AdGFP组的LC3Ⅱ蛋白相对表达水平为1.10±0.10,AdFBP1组的为0.30±0.01,F=90.36,P<0.01。激光共聚焦结果表明,AdGFP组肝癌细胞的平均自噬体数量为(28.33±1.53)个,AdFBP1组的为(12.33±1.53)个,F=97.40,P<0.01。另外,克隆形成实验和MTS实验结果显示,与AdGFP组相比,AdFBP1组肝癌细胞的增殖明显受到抑制。克隆形成实验结果表明,AdGFP组的细胞克隆为(65.66±2.57)个,AdFBP1组的细胞克隆为(34.00±2.00)个,F=141.50,P<0.01。MTS实验结果表明,AdGFP组96h的吸光度值为39.13±2.21,AdFBP1组在96h的吸光度值为30.61±3.33,F=7.80,P<0.05。结论FBP1抑制肝癌细胞HepG2的自噬及增殖。

摘要：目的探讨过氧化氢和黄曲霉毒素B1诱导肝癌细胞急慢性损伤后蛋白磷酸酶2A催化亚基(PP2A)的表达情况。方法采用不同浓度的过氧化氢(0、50、100、200、400、800μmol/L)或黄曲霉毒素B1(0、1.25、2.5、5、10、20、40μmol/L)诱导肝癌细胞(HepG2/Huh-7细胞)2、4、6、8和24、48 h后,倒置显微镜观察细胞形态,刃天青实验检测肝癌细胞活性,Western Blot检测去甲基化PP2A催化亚基C(PP2Ac)和总PP2Ac蛋白的表达情况。两组间比较用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析和析因设计资料两因素方差分析。结果HepG2/Huh-7细胞对过氧化氢和黄曲霉毒素B1诱导敏感,随着过氧化氢和AFB1浓度升高或孵育时间延长,细胞形态发生变化,数量减少。在2、4、6和8 h时间段,100μmol/L及以上浓度的过氧化氢诱导HepG2/Huh-7细胞后,随着过氧化氢浓度的升高,HepG2/Huh-7细胞活性逐渐下降,不同浓度过氧化氢与对照组(0μmol/L)比较,差异均有统计学意义(P值均0.05)。在24、48 h时间段,2.5μmol/L及以上浓度黄曲霉毒素B1诱导HepG2/Huh-7细胞后,随着浓度的升高,HepG2/Huh-7细胞活性逐渐下降,不同黄曲霉毒素B1浓度与对照组(0μmol/L)相比,差异均有统计学意义(P值均0.05)。用200μmol/L过氧化氢诱导HepG22 h后,总PP2Ac和去甲基化PP2Ac蛋白表达水平与对照组相比升高,差异均有统计学意义(t值分别为-5.553、-2.990,P值分别为0.005、0.040);400μmol/L过氧化氢诱导Huh-7细胞2 h后,总PP2Ac和去甲基化PP2Ac蛋白表达水平与对照组相比升高,差异均有统计学意义(t值分别为0.073、-5.149,P值分别为0.002、0.007)。用10μmol/L黄曲霉毒素B1诱导HepG2细胞2 h后,总PP2Ac和去甲基化PP2Ac蛋白表达水平与对照组相比升高,差异均有统计学意义(t值分别为-4.561、-5.788,P值分别为0.010、0.004);20μmol/L黄曲霉毒素B1诱导Huh-7细胞2 h后,总PP2Ac和去甲基化PP2Ac蛋白表达水平与对照组相比升高,差异均有统计学意义(t值分别为-5.120、-6.144,P值分别为0.007、0.004)。结论过氧化氢和黄曲霉毒素B1诱导肝癌细胞急慢性损伤后细胞形态发生变化,细胞活性降低,总PP2Ac和去甲基化PP2Ac蛋白表达升高。

摘要：目的探讨磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）在肝细胞癌（HCC）发生发展中的作用机制。方法设计靶向GPC3的siRNA，转染Huh7细胞后实时荧光定量聚合酶链反应（Real-timePCR）检测其对GPC3表达的抑制效果；选用抑制效果明显的小干扰RNA（siRNA）下调GPC3表达后，Westernblot法检测GPC3的蛋白表达水平，并用流式细胞仪、荧光显微镜观察及Transwell法分别对Huh7细胞的周期、增殖和侵袭进行检测。结果成功筛选出1条抑制效率达到74．87％的特异靶向GPC3的siRNA，可以显著抑制GPC3的转录翻译；同时，可见Huh7细胞的增殖和侵袭受到抑制，但并不影响细胞周期。结论GPC3的表达有利于HCC的增殖侵袭，其表达降低不利于HCC的发生发展。

摘要：目的 比较反向PCR（Inverse-PCR,IPCR）、Alu-PCR、接头PCR（Cassette-ligationmediated-PCR,CLM-PCR）三种PCR（Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应）方法在乙型肝炎病毒基因组（HBV DNA）整合位点筛选中的应用效果.方法 手术获取1例乙肝表面抗原（HBsAg）阳性的肝癌患者的肝癌组织,提取基因组DNA,设计相应引物,分别采用三种PCR方法进行扩增,将PCR产物回收,克隆至PMD18-T载体进行基因测序,利用BLAST工具进行序列比对,分析三种方法在乙型肝炎病毒（HBV）DNA整合位点确定中的效果.结果 采用Inverse PCR方法检测PCR产物后得到7个特异性电泳条带,克隆后得到测序结果22个,经序列比对发现3个整合位点;采用Alu-PCR方法,产物电泳得到13个特异性条带,得到测序结果32个,序列比对未发现整合位点;采用CLM-PCR方法,得到12个特异性电泳条带,得到测序结果4个,未发现整合位点.结论 在查找HBV整合位点的研究中,IPCR方法具有较稳定的扩增能力及较高的位点检测率.

摘要：目的检测小干扰RNA（siRNA）对肝癌耐药细胞株HepG2／阿霉素（ADM）多药耐药相关蛋白基因2（MRP2）及其蛋白产物的抑制作用，观察对多药耐药性的影响。方法使用浓度梯度法制作HepG2耐ADM细胞株（HepG2／ADM），ADM浓度从0．1～2．0mg／L；设计合成针对MRP2的siRNA小片段，转染HepG2／ADM耐药细胞，24h后通过实时荧光定量逆转录一聚合酶链反应（RT—qPCR）和Westernblot检测siRNA对MRP2基因mRNA和蛋白的抑制效果；噻唑蓝（MTT）比色法观察抑制MRP2基因表达后，HepG2／ADM细胞对化疗药物的敏感性变化，并计算各药物的半数抑制浓度（IC50）。结果HepG2／ADM对ADM、5-氟尿嘧啶（5-Fu）、长春新碱和奥沙利铂的IC50值分别为0．3204、3．8002、0．2014和0．1221；siRNA明显抑制了HepG2／ADM细胞MRP2基因mRNA和蛋白的表达（P〈0．05）；转染MRP2-siRNA后，HepG2／ADM细胞对ADM、5-Fu、长春新碱和奥沙利铂的IC50值明显减小，分别为0．1023、1．4417、0．0452和0．0268。结论用siRNA沉默MRP2基因能够逆转HepG2／ADM细胞对化疗药物的耐药性，MRP2基因与HepG2／ADM肝癌细胞的多药耐药性相关，可通过沉默MRP2基因提高耐药细胞对化疗药物的敏感性。

摘要：目的评价新型肿瘤标志物甲胎蛋白-IgM免疫复合物（AFP-IgM）对原发性肝细胞癌（PHC）的诊断意义。方法用酶联免疫吸附法与电化学发光法分别检测103名健康人、74例原发性肝细胞癌、27例中度肝硬化和63例慢性肝炎患者血清AFP-IgM与甲胎蛋白（AFP）含量。以非肝癌组（健康人、中度肝硬化和慢性肝炎）作为对照组。结果AFP的ROC曲线下面积大于AFP-IgM（0．85vs0．72，Z=3．21），并应用ROC曲线确定AFP-IgM和AFP的临界值分别为3×10^5AU／L和10μg／L。在此临界值下，AFP-IgM和AFP对PHC的敏感度分别为64．9％和79．7％，特异度分别为75．6％和80．3％，两者的有效性相近；但对早期（Ⅰ与Ⅱ期）肝癌诊断时，AFP-IgM的ROC曲线下面积大于AFP（0．91vs0．82，Z=1．73），差异具有统计学意义，其敏感度分别为94．4％和72．2％，特异度分别为81．9％和79．9％；联合检测以两项均为阳性诊断原发性肝癌：特异度可达89．1％，有效性为79．0％。结论采用AFP联合AFP-IgM检测可提高PHC诊断的特异度和有效性，但对于原发性肝癌的早期诊断AFP-IgM的敏感度与特异度均比AFP更高，AFP-IgM对原发性肝癌的早期诊断更具重要意义。