摘要：背景:重组腺病毒质粒的构建是重组腺病毒制备过程中的中枢环节,传统的细胞内同源重组法步骤多、成功率低、实验周期长。目的:构建含有大鼠白细胞介素10(rIL-10)基因的重组复制缺陷型腺病毒***-10,为真核表达及其动物模型的研究提供实验基础。设计、时间及地点:开放性实验,于2005-07/2006-04在中山大学附属第一医院完成。材料:SD大鼠1只。AdEasy系统由美国JohnHopkins肿瘤研究中心惠赠。ThermoscriptTMRTkit和Trizol为Invitrogen产品;HEK-293保存于中山大学动物实验中心细胞库;克隆大鼠白细胞介素10基因引物合成及测序由上海博亚生物技术有限公司完成。方法:采用反转录聚合酶链反应的方法从健康SD大鼠脾脏新鲜组织中提取的总RNA中克隆rIL-10基因,采用AdEasy-1腺病毒载体系统经***5183细菌内同源重组及HEK-293包装而获得重组腺病毒***-10。主要观察指标:用Westernblot和RT-PCR的方法鉴定***-10并进行滴度测定。结果:自健康SD大鼠脾脏组织中克隆rIL-10基因,构建出重组腺病毒***-10。经PCR扩增、酶切鉴定、DNA测序最终确定插入序列为rIL-10,Westernblot和RT-PCR均检测出细胞内rIL-10基因及其蛋白表达。再通过扩增、纯化后获得滴度为1.0×1014pfu/mL的重组腺病毒。结论:采用AdEasy-1系统,经细菌内同源重组及HEK-293细胞包装、扩增,纯化后获得足够数量和质量的病毒,方法简便易行,结果稳定可靠。

摘要：目的构建人白细胞介素 10重组腺病毒载体 ,为真核表达及其临床研究提供实验基础。方法自行设计一对引物 ,应用逆转录多聚酶链式反应 ( RT- PCR )技术 ,从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出 h IL - 10 c DNA,并将h IL - 10 c DNA克隆到腺病毒载体 p Ad CMV - L ink1中 ,构建 p Ad CMV/ h IL - 10表达质粒。将此表达质粒与腺病毒重组质粒p JM17共转染 2 93细胞 ,通过同源重组产生 h IL - 10重组腺病毒。结果扩增到的 c DNA片段经酶切鉴定、PCR扩增、DNA测序最终确定为 h IL- 10 c DNA;所得人白细胞介素 10重组腺病毒滴度为 1.9× 10 9pfu/ m L。结论本实验为今后研究 h IL-

摘要：背景:炎症反应是高同型半胱氨酸血症加速动脉粥样硬化潜在的分子机制之一,但其具体机制还有待阐明,TNFSF4基因及白细胞介素10因子是动脉粥样硬化的炎症相关因子,两者与高同型半胱氨酸血症的关系报道较少。目的:实验拟验证同型半胱氨酸对体外培养人单核细胞株细胞TNFSF4基因及白细胞介素10因子表达的影响。设计、时间及地点:随机对照体外细胞实验于2007-07/12在四川大学华西基础医学与法医学院病理生理学实验室完成。材料:THP-1单核细胞株由本室提供;高同型半胱氨酸、地塞米松和维生素D3由Sigma公司提供。方法:在由0.1μmol/L佛波脂诱导分化的THP-1单核细胞中加入200μmol/L的高同型半胱氨酸培养24,48,72h,将各时间点细胞上清液及裂解液作为条件培养基,加入经地塞米松及维生素D3作用6d后的培养瓶中继续培养24h。分为空白对照组;200μmol/L高同型半胱氨酸组;地塞米松+维生素D3组;24h高同型半胱氨酸条件培养基+地塞米松+维生素D3组;48h高同型半胱氨酸条件培养基+地塞米松+维生素D3组;72h高同型半胱氨酸条件培养基+地塞米松+维生素D3组。主要观察指标:应用反转录-聚合酶链反应检测TNFSF4基因mRNA表达水平差异;应用ELISA法检测其白细胞介素10蛋白表达的改变。结果:与空白对照组相比,高同型半胱氨酸处理24hTNFSF4基因mRNA表达变化不明显;48,72hTNFSF4基因mRNA表达显著增加;与地塞米松+维生素D3组相比,200μmol/L高同型半胱氨酸组各时间点白细胞介素10蛋白表达水平显著降低。结论:同型半胱氨酸可致THP-1巨噬细胞TNFSF4基因mRNA表达水平增加,同时致其白细胞介素10蛋白表达水平降低。

摘要：为获得鲤鱼白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)全长基因组序列,本研究利用鲤鱼IL-10全长cDNA序列(Gen-Bank登录号:JX524550),通过在两端非编码区设计引物,以提取的鲤鱼脾脏基因组为模板,使用PCR方法成功获得鲤鱼IL-10全长基因组序列。鲤鱼IL-10基因组全长2176bp,GenBank登录号为JX524551。将所获得的序列与其他物种IL-10基因组序列相比,结果发现都含有5个外显子,4个内含子,外显子在进化上相对保守,剪切位点都符合"gt......ag"规则;序列包含540bp的开放阅读框,编码179个氨基酸,有2段典型的IL-10氨基酸信号基序。

摘要：应用逆转录多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，自行设计并合成一对引物，成功地从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出ｈＩＬ－１０ｃＤＮＡ基因。并定向插入ｐＵＣ１８载体中，经ＤＮＡ序列测定最终确定为ｈｌＬ－１０ｃＤＮＡ基困，这将为令后ｈＩＬ－１０基因探针的制备和基因表达，进一步在基因水平上探讨ｈＩＬ－１０的生物学功能提供了物质基础。

摘要：目的:介绍细胞因子的检测方法,论述与多发性硬化相关的细胞因子γ-干扰素(Th1),白细胞介素10(Th2),转化生长因子β(Th3)的变化。资料来源:计算机检索Medline1994-09/2004-09与多发性硬化细胞因子相关的文章,检索词“cytokine,multiplesclerosis”,限定语言种类为“English”。计算机检索CNKI1994-09/2004-09相关的文章,限定语言种类为中文,检索词“细胞因子,多发性硬化”。资料选择:检索到200余篇文献,选择以细胞因子的检测方法,与多发性硬化有关的细胞因子γ-干扰素,白细胞介素10,转化生长因子β为主要研究内容的文献30篇,研究对象为动物或患者均纳入。资料提炼:30篇文献中2篇与细胞因子的研究方法相关,7篇与动物模型实验性变态反应性脑脊髓炎有关,21篇与多发性硬化细胞因子相关。资料综合:检测细胞因子的方法有多种:Northern印迹法、酶联免疫吸附实验、酶联免疫斑点实验、流式细胞术等。对多发性硬化患者细胞因子的检测结果不一,但多项研究显示γ-干扰素是多发性硬化肯定的促炎因子,而转化生长因子β1的产生增加与多发性硬化的保护和康复有关。结论:实验性变态反应性脑脊髓炎动物模型呈现较典型的Th1/Th2,Th3特征,但对多发性硬化细胞因子的研究因患者个体差异、标本来源、实验方法和实验设计的不同,目前难以得到一致的结果。

摘要：背景:树突状细胞在过敏性紫癜发病机制中可能具有重要的地位。已有报道黄芪在体内可以纠正过敏性紫癜患儿的Th1/Th2失衡,但目前关于黄芪在树突状细胞水平对过敏性紫癜病免疫功能调节的影响尚不清楚。目的:观察过敏性紫癜患儿外周血树突状细胞功能变化及黄芪对其的影响。设计、时间及地点:病例对照分析,于2005-10/2007-12在青岛大学医学院附属医院儿科研究所完成。材料:急性期过敏性紫癜患儿外周静脉血28份作为过敏性紫癜组,以门诊体检的健康同龄儿童外周静脉血18份作为正常对照组。黄芪水提剂由四川百利药业有限公司提供。方法:采用密度梯度离心法获取过敏性紫癜患儿及健康儿童外周血单个核细胞,获取的外周血单个核细胞体外经重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素4、重组人肿瘤坏死因子α以诱生树突状细胞,并培养8d,其中过敏性紫癜组又分成2组:对照组和黄芪干预组。主要观察指标:ELISA法检测过敏性紫癜患儿及健康儿童血浆γ-干扰素和白细胞介素4水平及培养上清液中白细胞介素10,12,18水平,流式细胞仪检测树突状细胞表面CD83、CD86(B7-2)和CD80(B7-1)的表达率。结果:过敏性紫癜患儿急性期外周血中Th1型细胞因子γ-干扰素水平减少,Th2型细胞因子白细胞介素4水平增加,γ-干扰素/白细胞介素4比值明显降低。过敏性紫癜患儿外周血单个核细胞经诱导培养的树突状细胞表面CD86表达率较正常对照组明显升高,且两组CD86表达率与血浆白细胞介素4水平皆呈显著正相关,与γ-干扰素/白细胞介素4比值皆呈显著负相关;CD80表达率明显低于正常对照组,且两组CD80表达率与血浆γ-干扰素水平及γ-干扰素/白细胞介素4比值均呈显著正相关。过敏性紫癜患儿树突状细胞分泌白细胞介素12水平低于正常对照组(P<0.05),而白细胞介素10,18水平均高于正常对照组(P<0.05),两组树突状细胞分泌白细胞介素12水平与血浆γ-干扰素水平皆呈显著正相关(P<0.01),与γ-干扰素/白细胞介素4比值皆呈正相关(P<0.01,P<0.05);白细胞介素10分泌水平与其血浆白细胞介素4水平皆呈显著正相关(P均<0.01),与γ-干扰素/白细胞介素比值皆呈负相关(P<0.01,P<0.05);白细胞介素18分泌水平与其血浆白细胞介素4水平皆呈显著正相关(P均<0.01),与γ-干扰素/白细胞介素4比值皆呈负相关(P<0.01,P<0.05)。黄芪干预组树突状细胞表面CD83、CD86和CD80的表达率与对照组差异不显著,树突状细胞分泌白细胞介素12水平高于对照组(P<0.01),白细胞介素10,18水平均低于对照组(P<0.05,P<0.01)。结论:①过敏性紫癜患儿外周血树突状细胞存在明显功能紊乱,表现为CD86表达率升高、CD80降低,白细胞介素12分泌减少、白细胞介素10和白细胞介素18增加,上述变化与Th1/Th2失衡关系密切。②黄芪主要是通过改变过敏性紫癜患儿树突状细胞分泌细胞因子的水平来调节其功能。

摘要：目的探讨细胞因子(TGF-β1、IL-10)与Stro-1+、Stro-1-间充质干细胞(MSC)免疫抑制效应的相关性。方法采用实时定量RT-PCR比较TGF-β1、IL-10在MSC两种细胞亚群中的表达,以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参照。以Pri mer Expre-ssTM软件进行引物设计,以Ct表示PCR的相对产量,ΔCt代表靶基因与GAPDH之间的Ct之差,以2-ΔΔCt表示ΔCt(Stro-1+MSC)与ΔCt(Stro-1-MSC)之间的比值;在3种不同条件下[①MSC单独培养;②MSC与混合淋巴反应体系(MLR)直接接触;③MSC通过Transwell与MLR间接接触],用ELISA法检测Stro-1+与Stro-1-细胞培养上清中TGF-β1的表达。结果IL-10在Stro-1+与Stro-1-MSC中均低表达,而TGF-β1在Stro-1-MSC中显著高表达(P<0.05);ELISA结果显示在3种培养条件下,TGF-β1在Stro-1-MSC中的表达均显著高于Stro-1+MSC(P<0.05)。结论Stro-1+MSC较Stro-1-MSC免疫抑制作用更显著,其与TGF-β1和IL-10的表达无关,表明TGF-β1、IL-10在MSC不同亚群免疫抑制效应中不起主要作用。

摘要：目的 探讨IL-10基因单核苷酸多态性与ALL发病易感性的关系.方法 选取2007年1月至2009年12月北京大学第一医院、北京市道培医院115例ALL缓解患者,同时选取323名体检健康者作为对照组.采集ALL患者的骨髓以及健康对照者的外周血标本,提取DNA.设计IL-10启动子区-819C/T、-592A/C引物做PCR,应用限制性内切酶Msl Ⅰ、HpyCH4Ⅲ分析其限制性片段长度多态性,并测序验证;同时分析IL-10基因-819位点、-592位点各基因型构成及等位基因在ALL患者组和健康对照组间的差异.用实时定量PCR检测ALL患者EB病毒DNA和BCR/ABL融合基因,分析IL-10基因-819位点、-592位点各基因型构成及等位基因在EB病毒阳性和阴性组间、BCR/ABL融合基因阳性和阴性组间的差异.结果 ALL患者组IL-10基因-819位点的-819CC、-819TT、-819CT基因型比例分别为14.8%（17/115）、45.2%（52/115）、40.0%（46/115）,-592位点的-592AA、-592CC、-592AC基因型比例分别为43.5%（50/115）、16.5%（19/115）、40.0%（46/115）;健康对照组-819位点的-819CC、-819TT、-819CT基因型比例分别为9.9%（32/323）、16.4%（53/323）、73.7%（238/323）,-592位点的-592AA、-592CC、-592AC基因型比例分别为11.8%（38/323）、15.5%（50/323）、72.8%（235/323）,ALL患者组与健康对照组间-819和-592位点基因型构成差异均有统计学意义（x2值分别为46.000和54.550,P均＜0.05＝.ALL患者组-819T等位基因比例为65.2%（150/230）,-592A等位基因比例为63.5%（146/230）,而健康对照组分别为53.5%（344/646）和48.1%（311/646）,差异均有统计学意义（x2值分别为9.877和15.986,P均＜0.05＝.ALL患者中42例检测了EB病毒DNA,其中EB病毒阳性22例,EB病毒阴性20例.EB病毒阳性组-819位点的-819CC、-819TT、-819CT基因型比例分别为9.1%（2/22）、40.9%（9/22）、50.0%（11/22）,-592位点的-592AA、-592CC、-592AC基因型比例分别为31.8%（7/22）、13.6%（3/22）、54.5%（12/22）,EB病毒阴性组分别为35.0%（7/20）、45.0%（9/20）、20.0%（4/20）和35.0%（7/20）、45.0%（9/20）、20.0%（4/20）,2组基因型构成差异均无统计学意义（P均＞0.05）.ALL患者中36例进行了BCR/ABL融合基因检测,其中阳性20例,阴性16例.BCR/ABL融合基因阳性组-819位点的-819CC、-819TT、-819CT基因型比例分别为0%（0/20）、45.0%（9/20）、55.0%（11/20）,-592位点的-592AA、-592CC、-592AC基因型比例分别为45.0%（9/20）、5.0%（1/20）、50.0%（10/20）,BCR/ABL融合基因阴性组分别为18.8%（3/16）、50.0%（8/16）、31.3%（5/16）和50.0%（8/16）、18.8%（3/16）、31.3%（5/16）,2组基因型构成差异均无统计学意义（P均＞0.05）.结论 IL-10基因-819位点TT基因型和-592位点AA基因型人群易患ALL.

摘要：为掌握猪圆环病毒2型(PCV2)ORF3蛋白免疫小鼠后引起其细胞因子变化的特征,设计了特异性引物,以PCV2FJ948167毒株的基因组DNA为模板,PCR扩增获得ORF3基因,并将其克隆到pSMK-sumo原核表达载体。把构建成功的重组质粒转化至BL21(DE3RIL strain)表达菌株,IPTG诱导后SDS-PAGE和Western-blot分析显示,ORF3基因已在大肠杆菌中表达,表达产物的分子质量约为32ku。将分离纯化后的ORF3蛋白免疫小鼠,检测免疫后不同时间点IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-12在血清中的质量浓度。结果显示,免疫后小鼠血清中IL-4的质量浓度显著升高(P<0.05),而IL-10、IL-12和INF-γ的质量浓度没有明显的变化。结果表明,ORF3蛋白在PCV2诱发的体液免疫中发挥一定的作用。