摘要：背景:有研究表明,骨髓间充质干细胞易于外源基因的导入和表达,且具有较弱的免疫抗原性和免疫调节功能,强大的迁移力和趋瘤性,因而逐渐显露其具有作为抗肿瘤基因治疗负载体系的优越性。目的:拟应用白细胞介素12重组腺病毒质粒AdEasy-白细胞介素12转染骨髓间充质干细胞,构建表达外源性白细胞介素12的骨髓间充质干细胞。设计、时间及地点:以细胞为对象的开放性实验,于2008-06在辽宁医学院实验中心及中国医科大学实验中心完成。材料:原代骨髓间充质干细胞由辽宁医学院外科学实验室构建,白细胞介素12重组腺病毒载体AdIL-12由辽宁医学院分子生物学实验室构建。方法:分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,免疫组织化学及流式细胞技术鉴定细胞表面标志物,应用腺病毒介导白细胞介素12基因转染大鼠骨髓间充质干细胞。主要观察指标:以反转录-聚合酶链反应及Western Blotting技术检测转染后的骨髓间充质干细胞的白细胞介素12基因mRNA及蛋白表达。结果:腺病毒介导白细胞介素12基因转染骨髓间充质干细胞后,通过反转录-聚合酶链反应及Western Blotting技术检测,结果证实白细胞介素12基因在mRNA及蛋白水平均有表达,而未经转染的骨髓间充质干细胞内无白细胞介素12基因及蛋白表达。结论:应用白细胞介素12重组腺病毒质粒成功构建了在mRNA及蛋白水平表达外源性白细胞介素12基因的骨髓间充质干细胞。

摘要：背景:白细胞介素12作为最具潜力的抑瘤因子一直是研究的热点,但其在结直肠癌方面的研究相对较少。目的:构建稳定表达人白细胞介素12的大鼠骨髓间充质干细胞株(h IL-12-BMSCs),观察其对大鼠结肠癌模型的影响。方法:设计并合成引物,PCR扩增并回收纯化后的p40和p35基因片段,行Overlap-ping PCR连接获得h IL-12的单链双亚基表达融合基因,与慢病毒包装系统共转染293T细胞,构建慢病毒过表达重组体,再转染大鼠骨髓间充质干细胞,药物筛选培育出稳转株。32只裸鼠皮下注射CT26细胞悬液造模成功后,随机分为4组:瘤周分别注射0.2 m L h IL-12-BMSCs(h IL-12-BMSCs组)、0.2 m L PBS溶液(PBS组)、0.2 m L骨髓间充质干细胞(骨髓间充质干细胞组)、0.2 m L表达IL-12的慢病毒液(LV-IL-12组),统计并分析各组瘤体生长情况。结果与结论:(1)观察期内PBS组与骨髓间充质干细胞组肿瘤体积差异无显著性意义(P>0.05),表明骨髓间充质干细胞本身对CT26瘤体生长无明显促进或抑制作用;(2)注射7 d后h IL-12-BMSCs组与PBS组、PBS组与LV-IL-12组间肿瘤体积差异均有显著性意义(P<0.01),表明白细胞介素12对CT26瘤体生长有明显抑制作用;(3)注射10 d后h IL-12-BMSCs组与LV-IL-12组间肿瘤体积差异有显著性意义(P<0.05),表明h IL-12-BMSCs抑制CT26生长优于LV-IL-12;(4)结果表明,h IL-12-BMSCs对裸鼠CT26移植瘤体生长有明显的抑制作用。

摘要：目的:探讨人白细胞介素12(IL-12)两个亚基基因通过连接肽基因进行拼接的新方法。为进一步研究IL-12基因的生物学功能以及应用提供实验基础。方法:采用两个牛弹性蛋白基序(10个氨基酸)的基因序列为两个亚基基因拼接的连接肽基因。根据人IL-12p35、p40两个亚基基因片段以及连接肽基因核苷酸序列设计引物,其中p40基因下游引物包括部分连接肽基因序列以及KpnⅠ酶切位点,p35基因上游引物包括部分连接肽基因序列以及KpnⅠ酶切位点。通过聚合酶链反应(PCR)方法分别获得人IL-12p35与p40基因片段。利用KpnⅠ内切酶对p35与p40基因的PCR产物进行酶切,酶切产物回收后利用T4DNA连接酶进行连接,应用p40基因上游引物与p35基因下游引物对连接产物进行PCR扩增。利用KpnⅠ内切酶对连接产物进行酶切鉴定。将扩增的连接产物克隆入T载体,挑选阳性克隆并进行酶切鉴定,酶切鉴定正确的克隆进行拼接产物的核苷酸序列测序。结果:通过PCR分别获得约1000bp大小的p40基因片段与600bp大小的p35基因片段,两个基因酶切片段连接后PCR扩增获得1600bp左右的拼接产物,采用KpnI内切酶对拼接产物进行酶切后获得约1000和600bp大小的基因片段,分别与p40和p35基因片段大小一致。拼接产物的T载体经酶切鉴定可见1600bp大小的酶切产物,拼接产物测序结果与GenBank核酸数据库上的p40基因、p35基因以及连接肽基因核苷酸序列完全一致。结论:利用该基因分子拼接技术成功地将人白介素12两个亚基基因通过连接肽基因进行拼接。建立了一种简单、方便、有效进行人白细胞介素12两个亚基基因拼接的新方法,为进一步研究IL-12的生物学功能以及基因治疗提供实验基础。

摘要：背景:青藤碱是从抗风湿中药青风藤中分离提取的单体生物碱,具有抗炎、镇痛、免疫抑制等药理作用,该药用于治疗类风湿性关节炎等风湿性疾病具有较明确的疗效,在临床上得到了广泛的应用。树突状细胞是目前所知的机体内功能最强的抗原提呈细胞。目的:观察不同剂量青藤碱对树突状细胞CD80和CD86表达及胞外白细胞介素12分泌的影响。设计:重复测量实验。单位:广东医学院药理教研室。材料:实验于2004-09/2005-05在解放军第三军医大学全军免疫学研究所完成。健康志愿者外周血由西南医院血库提供。青藤碱由湖南正清药业有限公司提供。RPMI1640培养基购于Hyclone公司,FITC标记的单克隆抗体CD80、CD86、鼠免疫球蛋白亚型IgG1均购于eBioscience公司,重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子,重组人白细胞介素4,肿瘤坏死因子α购于PE公司。人白细胞介素12ELISA试剂盒购于法国Diaclone公司。方法:取健康志愿者外周血稀释,培养,按重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子1×106U/L、重组人白细胞介素45×105U/L终浓度加入细胞因子,培养7d后可获得树突状细胞。①将常规培养7d后的树突状细胞调整细胞浓度为2×108L-1,加入6孔培养板,分别加入青藤碱使其终浓度为3,10,30mg/L以及肿瘤坏死因子α使其终浓度为10μg/L,同时设对照组,于第9天分别收集悬浮细胞,每管取2×105细胞,用PBS洗涤2次,加入20μLFITC标记的CD80或CD86,对照管则加入鼠免疫球蛋白亚型IgG1,4℃避光孵育30min,充分洗涤后,10g/L多聚甲醛固定,将细胞悬液在流式细胞仪上进行分析。②将常规培养7d后的树突状细胞调整细胞浓度为2×108L-1,加入6孔培养版,分别加入青藤碱使其终浓度为3,10,30mg/L以及肿瘤坏死因子α使其终浓度为10μg/L,同时设对照组,继续培养48h后,收集上清进行白细胞介素12测定。白细胞介素12的检测采用夹心ELISA法检测胞外的白细胞介素12分泌量,按试剂盒说明操作。主要观察指标:①不同剂量青藤碱对树突状细胞表面CD80及CD86表达的影响。②不同剂量青藤碱对树突状细胞分泌白细胞介素12的影响。结果:①树突状细胞表面CD80及CD86表达:不同剂量青藤碱组与对照组树突状细胞表面CD80分子阳性表达率及平均荧光强度差异无统计学意义(P>0.05),各组细胞表面CD86分子阳性表达率及平均荧光强度差异亦无统计学意义(P>0.05)。②各组树突状细胞分泌白细胞介素12水平检测结果:由ELISA测量值可见,青藤碱小、中、大剂量组树突状细胞白细胞介素12水平分别为(863.1±33.7),(668.8±31.9),(512.6±29.6)ng/L,高于对照组[(922.2±36.6),P<0.05-0.01],随青藤碱剂量增大,抑制树突状细胞分泌白细胞介素12水平呈依赖性减少。结论:青藤碱可剂量依赖性地抑制树突状细胞分泌白细胞介素12,而对树突状细胞表面CD80和CD83表达无明显影响;青藤碱的抗类风湿作用可能与其抑制树突状细胞分泌白细胞介素12有关。

摘要：目的构建下游可以共表达人白细胞介素12(hIL12)双亚基的双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES-hIL12。方法通过搭桥PCR获得人白细胞介素12P35及P40双亚基的融合基因P35-F2A-P40,插入DNA疫苗载体pVAX1-IRES的下游,瞬时转染293-T细胞,ELISA检测融合基因的表达。结果酶切鉴定和序列分析表明融合基因与设计完全一致,融合基因在体外细胞培养液检测中获得分泌表达。结论该载体的成功构建可以为肿瘤基因疫苗研制提供免疫增效载体。

摘要：背景：中药3’-甲异靛玉红及，靛玉红衍生物在抗肿瘤的同时对机体正常免疫细胞影响的报道查及较少。目的：观察3’-甲异靛玉红对C57BL／6小鼠胸腺、脾淋巴细胞增殖的影响。设计、时间及地点：随机分组细胞病理学观察实验，于2007-08／2008-01在南方医科大学珠江医院完成。材料：实验动物为C57BL／6小鼠，雄性，6-8周龄，体质量（204-2）g。方法：取C57BL／6小鼠胸腺、脾组织研磨过滤为单细胞悬液，应用5，10，15，20，25μmol／L甲异靛玉红处理C57BL托小鼠胸腺和脾细胞。以未经任何药物处理的C57BL／6小鼠作为空白对照，以给予刀豆蛋白A处理的C57BL／6小鼠为阳性对照。主要观察指标：①MTT法测定C57BL／6小鼠脾和胸腺淋巴细胞的增殖。②ELISA法测定培养上清中自细胞介素12活性。③流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡率及死亡率，细胞内活性氧浓度。④RT-PCR法检测细胞bcl-2和cdk2 mRNA水平。⑤荧光显微镜检测细胞Bcl．2、Bax和CDK2蛋白表达率。结果：15，20，25μmol／L甲异靛玉红作用24h均可明显抑制C57BL／6小鼠胸腺、脾淋巴细胞增殖（P〈0．05），并呈量效、时效依赖性。各浓度的甲异靛玉红对C57BL／6小鼠胸腺和脾细胞各时间点分泌白细胞介素12的功能较对照组明显减低（P〈0．05）。15μmol／L的3’-甲异靛玉红可导致C57BL／6小鼠胸腺、脾淋巴细胞凋亡相关蛋白bcl-2和细胞周期蛋白cdk2 mRNA表达水平均减低，Bcl-2的蛋白表达水平降低，CDK蛋白表达减低，Bax表达水平升高，Bcl-2／Bax比例明显下降，启动细胞凋亡。15μmol／L的3’-甲异靛玉红将C57BL／6小鼠胸腺、脾淋巴细胞阻遏于G2／M期，细胞内活性氧水平呈量效、时效依赖性升高。结论：一定浓度范围甲异靛玉红可逆性抑制C57BL／6小鼠体外培养的脾及胸腺淋巴细胞增殖，同时抑制白细胞介素12的分泌，并启动细胞凋亡。

摘要：目的构建小鼠白细胞介素-12的融合基因,并进行初号表达。方法通过重叠序列引物的设计与多聚酶链反应(PCR)技术,将小鼠IL-12的40kDa多肽链基因与35kDa多肽链基因,以甘氨酸接头(Gly4Ser)3序列连接成为融合蛋白编码基因,构建融合蛋白表达载体,转染小鼠成纤维细胞SVT2,表达具有生物学活性的融合蛋白型IL-12。结果构建的小鼠IL-12表达载体经测序无突变发生。以G418筛选转染的SVT2细胞,获得数十个抗性细胞克隆,测定其IL-12生物学活性,分泌量达52.1～112.6pg/ml。表达的融合型小鼠IL-12具有生物学活性。

摘要：目的探讨预输注转染白细胞介素12p35亚基干扰RNA(Ib-12p35siRNA)的供者来源树突状细胞对移植心脏存活时间的影响。方法制备供者BALB/c小鼠骨髓来源的树突状细胞,培养7d后,根据实验设计,分别以携带IL-12p35siRNA或HKsiRNA的重组腺病毒载体转染树突状细胞。移植前7d,经受者C57BL/6小鼠尾静脉注射转染IL-12p35siRNA的树突状细胞(p35组)和转染HKsiRNA的树突状细胞(HK组),并设未转染的对照组(未转染组),然后进行供、受者间的异位(颈部)心脏移植。术后观察移植心脏的存活情况,术后第14d采取静脉血,以酶联免疫吸附试验测定血清中自细胞介素2(IL-2)、IL-4、IL-10和γ干扰素(INF-γ)的水平。结果术后未转染组移植心脏的存活时间为(7．83±1．61)d,HK组为(7．17±1．60)d,p35组移植心脏存活时间明显延长,为(20．17±2．71)d,与HK组和未转染组相比,差异有统计学意义(P＜0．01)。p35组IL-2和INF-γ的水平明显低于HK组和未转染组(P＜0．01),而IL-4和IL-10的水平明显高于HK组和未转染组(P＜0．01)。结论预输注转染IL-12p35siRNA的供者树突状细胞能延长同种小鼠移植心脏的存活时间。

摘要：背景:鉴于树突状细胞迁移在急性排斥反应发生机制中占据重要地位,人们通过使用某些药物延缓树突状细胞的迁移或通过阻断未成熟树突状细胞向成熟树突状细胞的转变来防治急性排斥反应。目的:观察灯盏花提取物对异基因大鼠肾脏移植模型血液中树突状细胞的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-11/2009-05在天津市人民医院进行。材料:灯盏花提取物由南开大学化学元素研究所提供。灯盏花属掌叶大黄类植物,提取物中包含2,5-二甲基-7-羟基色原酮、5,7,4’-三羟基黄酮(黄酮甙元)。肾脏供体为32只清洁级雄性Wistar大鼠,32只SD大鼠为受体。方法:行原位左肾移植手术并同时切除受体右侧肾脏,移植后,按照随机数字表法分为生理盐水组、灯盏花提取物低、中、高剂量组。灯盏花提取物低、中、高剂量组分别腹腔注射灯盏花提取物5,10,15mg/(kg?d),生理盐水组腹腔注射生理盐水。术后5d收集大鼠外周血,经红细胞裂解液和淋巴细胞分离液处理后,接种于培养皿中,2h后除去悬浮细胞,调整浓度1×109L-1加入1640完全培养液放于37℃、体积分数5%CO2培养箱中,第3天半量换液,第7天收获细胞。主要观察指标:观察树突状细胞形态并测定成熟状态;酶联免疫吸附法检测白细胞介素12水平;混合淋巴细胞培养测定细胞的抗原递呈功能。结果:生理盐水组树突状细胞树突分支增加、增粗、近圆形,体积较大,多角形或具有特征性的星形。灯盏花提取物作用下的细胞相对幼稚、稀疏,高剂量时差异更明显。灯盏花提取物组CD40、CD80、主要组织容性抗原Ⅱ表达率和白细胞介素12分泌量较生理盐水组明显降低(P<0.01),随灯盏花提取物剂量增加,下降更明显(P<0.01)。反应和刺激细胞按10∶1比例混合后,生理盐水组树突状细胞刺激淋巴细胞增殖的作用最强(P<0.01),随灯盏花提取物剂量增加,刺激作用逐渐降低(P<0.01)。结论:灯盏花提取物能抑制大鼠肾移植后外周血中树突状细胞的成熟和功能,随剂量加大,抑制作用增强。

摘要：背景:树突状细胞在过敏性紫癜发病机制中可能具有重要的地位。已有报道黄芪在体内可以纠正过敏性紫癜患儿的Th1/Th2失衡,但目前关于黄芪在树突状细胞水平对过敏性紫癜病免疫功能调节的影响尚不清楚。目的:观察过敏性紫癜患儿外周血树突状细胞功能变化及黄芪对其的影响。设计、时间及地点:病例对照分析,于2005-10/2007-12在青岛大学医学院附属医院儿科研究所完成。材料:急性期过敏性紫癜患儿外周静脉血28份作为过敏性紫癜组,以门诊体检的健康同龄儿童外周静脉血18份作为正常对照组。黄芪水提剂由四川百利药业有限公司提供。方法:采用密度梯度离心法获取过敏性紫癜患儿及健康儿童外周血单个核细胞,获取的外周血单个核细胞体外经重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素4、重组人肿瘤坏死因子α以诱生树突状细胞,并培养8d,其中过敏性紫癜组又分成2组:对照组和黄芪干预组。主要观察指标:ELISA法检测过敏性紫癜患儿及健康儿童血浆γ-干扰素和白细胞介素4水平及培养上清液中白细胞介素10,12,18水平,流式细胞仪检测树突状细胞表面CD83、CD86(B7-2)和CD80(B7-1)的表达率。结果:过敏性紫癜患儿急性期外周血中Th1型细胞因子γ-干扰素水平减少,Th2型细胞因子白细胞介素4水平增加,γ-干扰素/白细胞介素4比值明显降低。过敏性紫癜患儿外周血单个核细胞经诱导培养的树突状细胞表面CD86表达率较正常对照组明显升高,且两组CD86表达率与血浆白细胞介素4水平皆呈显著正相关,与γ-干扰素/白细胞介素4比值皆呈显著负相关;CD80表达率明显低于正常对照组,且两组CD80表达率与血浆γ-干扰素水平及γ-干扰素/白细胞介素4比值均呈显著正相关。过敏性紫癜患儿树突状细胞分泌白细胞介素12水平低于正常对照组(P<0.05),而白细胞介素10,18水平均高于正常对照组(P<0.05),两组树突状细胞分泌白细胞介素12水平与血浆γ-干扰素水平皆呈显著正相关(P<0.01),与γ-干扰素/白细胞介素4比值皆呈正相关(P<0.01,P<0.05);白细胞介素10分泌水平与其血浆白细胞介素4水平皆呈显著正相关(P均<0.01),与γ-干扰素/白细胞介素比值皆呈负相关(P<0.01,P<0.05);白细胞介素18分泌水平与其血浆白细胞介素4水平皆呈显著正相关(P均<0.01),与γ-干扰素/白细胞介素4比值皆呈负相关(P<0.01,P<0.05)。黄芪干预组树突状细胞表面CD83、CD86和CD80的表达率与对照组差异不显著,树突状细胞分泌白细胞介素12水平高于对照组(P<0.01),白细胞介素10,18水平均低于对照组(P<0.05,P<0.01)。结论:①过敏性紫癜患儿外周血树突状细胞存在明显功能紊乱,表现为CD86表达率升高、CD80降低,白细胞介素12分泌减少、白细胞介素10和白细胞介素18增加,上述变化与Th1/Th2失衡关系密切。②黄芪主要是通过改变过敏性紫癜患儿树突状细胞分泌细胞因子的水平来调节其功能。