摘要：拓扑异构酶Ⅰ(TopoisomeraseⅠ,TopoⅠ)抑制剂已成为新型抗肿瘤药物研究的热点.识别靶酶上全新的药物结合位点对于设计、优化TopoⅠ抑制剂具有重要意义,据此设计的化合物不仅可以创新结构类型,克服现有的喜树碱类药物的毒性,而且有望很好地解决与现有的喜树碱类药物的交叉耐药性问题.通过对真核DNA拓扑异构酶Ⅰ蛋白超家族多元序列联配研究,构建了蛋白质系统进化树,并在此基础上采用进化踪迹分析识别得到了人拓扑异构酶Ⅰ上重要功能残基.研究发现,喜树碱分子7,9位周围存在亚家族特异性的疏水性残基Ala351,Met428,Pro431,表明在喜树碱分子对应区域引入疏水性基团取代,会提高抗肿瘤活性.尤其值得注意的是,超家族保守的蛋白残基Lys436,有望成为新型喜树碱类药物改造的重要靶点,据此设计的新型化合物将有望解决喜树碱类药物水溶性差的问题.此外,突变将导致喜树碱耐药性的蛋白残基Asn352,Arg364为真核TopoⅠ蛋白超家族保守残基,由于对接研究已表明它们均不与喜树碱直接相互作用,因此它们将是发现新型非喜树碱类TopoⅠ抑制剂的重要药物结合位点.

摘要：[目的]构建包含人乙型肝炎病毒(HBV)S基因与PreS2／S基因的重组载体。[方法]设计合成2对寡核苷酸引 物,以adr亚型HBV质粒pHBV DNA为模板,采用PCR法分别扩增HBV S基因、PreS2／S基因片段;用HindⅢ和BamHⅠ双酶 切后,分别连接到质粒pcDNA3.1相应酶切位点,转化宿主菌JM109,分别用上述内切酶双酶切及DNA测序鉴定重组质粒。 [结果]酶切鉴定示所切下的片段大小均与预计相符。测序结果与文献报道序列及预计结果一致。[结论]成功构建了S基因与 PreS2／S基因的重组载体。

摘要：目的:构建人第10号染色体缺失的磷酸酶(PTEN)真核重组质粒pCDNA3.1-Flag-PTEN和原核重组质粒pGEX-6P-1-GST-PTEN,研究PTEN融合质粒生物学效应。方法:根据基因库中PTEN序列,设计并合成相关引物。用基因重组技术将目的片段插入pCDNA3.1-Flag和pGEX-6P-1-GST空载质粒中,通过PCR和DNA测序,鉴定插入基因序列。将pCDNA3.1-Flag-PTEN转染到HEK 293细胞,将pGEX-6P-1-GST-PTEN转到*** BL-21中,通过Western blotting和考马斯亮蓝染色法分别检测PTEN蛋白的表达。结果:PCR显示目的基因插入成功;DNA测序显示插入序列与目的基因序列完全一致,无位点突变;Western blotting和考马斯亮蓝染色法证实融合质粒可以在生物体内正确表达。结论:成功构建PTEN相关真核和原核融合质粒并正确表达,为PTEN在帕金森疾病中的机制研究奠定了基础。

摘要：将大鼠脑原生型一氧化氮合酶（cNOS）全长cDNA定向插入pRC／CMVpolylinker区，获得真核细胞表达载体pCMVcNOS。以pCMVcNOS为模板，cNOS内部基因序列设计的引物进行PCR扩增，证明cNOS基因的存在。经酶切检测进一步证实插入方向完全正确。用磷酸钙共沉淀法和LipofectinTM法将pCMVcNOS转染NG108-15细胞，用含600mg／LG418培养基筛选和增殖抗性单克隆细胞，通过3H-精氨酸转化3H-胍氨酸法测定各细胞克隆可溶相和颗粒相cNOS活性，筛选高效稳定表达的细胞株。从42株抗G418单克隆细胞林中筛选到3株稳定高效表达细胞，在表达的cNOS活性中，可溶相增加更为明显。本实验结果证实，得到高效表达原生型一氧化氮合酶的神经细胞株。

摘要：目的在真核细胞中表达Zhejiang Children’s Hospital（ZCH）-7-2F9（简称2F9）单链抗体（scFv2F9）以获得高活性的目的蛋白，为2F9其他类型的基因工程抗体及其免疫毒素的研究奠定基础。方法根据pSectag2A多克隆位点、（G4S）3及scFv2F9基因序列，设计含有SfiI、EcoRI酶切位点、6×His以及终止密码TGA的引物，采用高保真的Taq酶，通过重叠延伸拼接法（splicing by overlap extension，SOE）扩增克隆到scFv2F9基因，将扩增到的目的基因片段克隆到pGEM T—easy载体，测序核实后再克隆到pSectag2A真核分泌型表达载体中。阳性重组质粒pSectag2A／scFv2F9转染中华仓鼠卵巢（CHO）细胞进行目的蛋白的瞬时表达，将培养上清浓缩后，流式细胞术观察其对亲本单抗的阻滞效果。结果真核分泌型表达载体pSectag2A／scFv2F9在CHO细胞中获得成功表达，其相对分子质量为31000。亲本直标单抗2F9-FITC被真核细胞表达的scFv2F9阻滞后其阳性细胞百分数、平均荧光强度和最高峰值分别下降了90．02％、63．30％和63．38％。结论克隆到的2F9V。和2F9VL基因及构建的真核分泌型表达载体pSectag2A／scFv2F9是正确的，scFv2F9在CHO细胞中获得成功的表达，且有较高的识别和结合人CD14抗原的功能。

摘要：根据日本血吸虫促凋亡基因SjB AD的参考序列设计引物,应用PCR技术扩增SjB AD,选用pcD NA3.1(+)真核表达载体,构建pcDNA3.1(+)-SjB AD,并将其转染到293T细胞内,采用实时定量PCR检测SjB AD在转染入293T细胞培养不同时期后的转录水平;利用细胞流式术检测pcD NA3.1(+)-SjB AD转染入293T细胞后细胞的凋亡水平。结果:成功克隆、表达了日本血吸虫SjB AD基因,构建了真核重组表达质粒pcD NA3.1(+)-SjB AD,并将其转染入293T细胞内,利用实时定量PCR检测SjB AD在转染入293T细胞培养36h后转录水平最高。利用细胞流式术检测pcD NA3.1(+)-SjB AD转染入293T细胞后可以引起细胞凋亡。本文为研究线粒体细胞凋亡通路和血吸虫的生长发育奠定基础。

摘要：目的构建人Arresten基因的真核表达质粒。方法设计人Arresten基因引物序列,取100 mg新鲜的胎盘组织提取总RNA,采用RT-PCR法扩增Arresten基因。将获取的Arresten基因片段和p IRES2-EGFP质粒分别用Bam HⅠ和EcoRⅠ作双酶切,将酶切产物与质粒连接,转化感受态大肠杆菌DH-5α进行真核表达。采用酶切、菌液PCR及测序的方法检测Arresten基因真核表达质粒构建的正确性。结果经双酶切鉴定,得到1条约700 bp的片段和1条与p IRES2-EGFP空载体(5.3 kb)相近的片段,符合Arresten基因重组质粒大小。经重组质粒的菌液PCR鉴定,7组菌液均扩增出700 bp大小的扩增片段,均为阳性克隆。测序结果示,Arresten基因mRNA与GenBank中人Arresten序列完全一致。结论成功构建了人Arresten基因的真核表达质粒。

摘要：The eukaryotic genome is packaged into a complex nucleoprotein structure named chromatin, balancing the compactness of genome and the accessibility of regulatory proteins and RNA polymerases to DNA. The mechanisms of the regulation of chromatin dynamics include the post-translational modification of histones, alteration of nucleosome positions by chromatin remodelers, replacement of canonical histones by histone variants with the aid of histone chaperones, and dynamic organization of the three-dimensional genome in the small nucleus. Histone variants are different from canonical histones by substitution of several amino acid residues or changes in amino acid sequence. Histone variants perform specialized functions such as altering nucleosome stability, dynamics, structure, as well as playing critical roles in a range of biological processes like transcriptional regulation, DNA repair and recombination, development and immune responses. Here we discuss how histone variants, their modification and specific loading to chromatin are involved in transcriptional regulation, DNA repair and plant development.

摘要：根据已知的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶基因ORF全长序列,分别设计1对带有粘性末端酶切位点EcoRI和NotI的特异性引物,PCR克隆得到桦褐孔菌内切葡聚糖酶(endo-l,4-β-D-glucanase,EG)和β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase,BGL)ORF基因全长,将酶切后的目的片段分别与真核表达载体pPICZαA连接,构建出真核表达载体pPICZαA-EG和pPICZαA-BGL,并成功转化到毕赤酵母GS115中,为下一步纤维素酶的表达和功能验证奠定了基础。

摘要：根据已发表的PRV -Rice株的gE基因序列设计了一对引物 ,以PRV -MinA株的DNA为模板 ,用PCR法特异性地扩增出了PRVMin-A株的 gE基因 ,并克隆到 pUC19中 ,再与杆状病毒转座质粒 pFastBac1连接得到pFastBac -gE ,pFastBac-gE转化穿梭载体Bacmid,得到了重组rBacmid-gE表达载体。