摘要：[目的]克隆马山黑山羊丝裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8,MAPK8)基因序列,并对该基因进行生物信息学分析,构建其真核表达载体,为山羊乳腺发育及MAPK8基因在转分化过程中的研究提供试验材料。[方法]参考山羊MAPK8基因序列(GenBank登录号:XM_018042429.1)设计引物,利用PCR扩增马山黑山羊MAPK8基因CDS序列并克隆;分别使用DNAStar和Mega 11.0软件进行序列比对及系统进化树构建,并利用ProtParam、ProtScale等软件进行生物信息学分析;构建真核表达载体并进行慢病毒包装后收集病毒液上清,感染马山黑山羊成纤维细胞,并通过实时荧光定量PCR检测感染病毒组和对照组MAPK8基因表达水平。[结果]马山黑山羊MAPK8基因CDS区全长1 155 bp,编码384个氨基酸,蛋白分子质量为43.98 ku,分子式为C_(1968)H_(3114)N_(528)O_(569)S_(22),等电点(pI)为7.13。相似性比对结果显示,马山黑山羊与不同物种间MAPK8基因氨基酸序列相似性均高于85%,表明MAPK8氨基酸序列较为保守。系统进化树显示,马山黑山羊MAPK8基因氨基酸序列与牛的亲缘关系最近,与斑马鱼的亲缘关系最远。马山黑山羊MAPK8蛋白为亲水性,不属于跨膜蛋白,主要分布在细胞质(52.2%)、线粒体(26.1%)、细胞核(17.4%)和细胞膜(4.3%)中,含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域(第26―321位氨基酸处)。MAPK8蛋白二级结构包括无规则卷曲、α-螺旋、β-转角和延伸链。互作蛋白预测显示,MAPK8蛋白可能与MAPK9、JUN、TP53、FOS、JUNB、MAP2K4、MAP2K7、MAPK8IP1和NFATC3蛋白存在互作。试验成功构建MAPK8基因慢病毒真核表达载体pCDH-CMV-MAPK8-mchery-Puro,转染马山黑山羊成纤维细胞后产生红色荧光信号,试验组细胞内MAPK8基因表达量极显著高于对照组(P<0.01)。[结论]本研究成功克隆了马山黑山羊MAPK8基因CDS序列,并构建了pCDH-CMV-MAPK8-mchery-Puro真核表达载体,为山羊MAPK8基因功能及应用研究提供了基础数据。

摘要：目的:设计并表达预防16型人乳头瘤病毒感染的重组蛋白疫苗。方法:选取HPV16型病毒L1蛋白上的B表位和T表位,将其连接组合成多种方式,利用计算机预测蛋白质的三维结构,选取其中最优的结构进行基因克隆构建,并利用杆状昆虫系统进行表达。结果:利用计算机设计出了一种重组蛋白,成功构建了该重组蛋白的结构基因,并在杆状昆虫表达系统中得到表达。结论:成功构建并表达了人乳头瘤病毒的重组蛋白疫苗。

摘要：背景:CTLA-4lg的制备过程比较复杂,单克隆抗体的价格比较昂贵,而且应用CTLA-4lg单克隆抗体注射本身存在着血浆药物浓度不稳定的问题。目的:探讨Ctla4lg表达质粒构建的可行性。设计、时间及地点:基因水平观察实验,于2005/2006在中国医科大学中心实验室完成。材料:雄性Wistar大鼠10只,近交系昆明小鼠10只。方法:提取Wistar大鼠总RNA,反转录成cDNA第1链,PCR扩增CTLA4基因,将其和真核表达载体pcDNA3酶切、连接。转化感受态菌DH5α,培养后挑取阳性克隆、提取质粒,酶切鉴定重组子、测序,最后转染近交系昆明小鼠,应用Westen Blot法检测血清CTLA4lg水平。主要观察指标:构建的Ctla4lg表达质粒基因序是否正确以及能否在小鼠体内进行蛋白表达。结果:对含有pcDNA3-CTLA4质粒的LB菌液进行鉴定测序,目的基因片断大小为288bp,与Genebank上公布的CTLA4序列完全一致,质粒构建正确。利用阳性脂质体载体包被pcDNA3-CTLA4lg转染小鼠,有3只在第7天血清检测CTLA4Ig阳性,显示pcDNA3-CTLA4lg能够在鼠肌细胞内表达。结论:利用基因合成和重组技术成功构建了真核表达载体pcDNA3-CTLA4Ig,利用脂质体法成功的将pcDNA3-CTLA4lg转染到鼠肌细胞内并进行表达。

摘要：目的真核表达人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)融合蛋白(fusion protein,F),并完成蛋白纯化及纯度测定。方法根据编码F蛋白的基因序列设计引物,PCR方法扩增出3′端带His标签的F基因序列,克隆入pGEM-T-easy载体,经核酸序列分析后,进一步克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体,限制性内切酶鉴定,用脂质体Lipofectamine 2000转染COS-7细胞,72h后再用Western blot检测目的蛋白的表达。Ni柱亲和层析纯化COS-7细胞表达的F蛋白,高效毛细管电泳分析纯化后蛋白纯度。结果核酸序列分析证实获得带His标签的RSVF基因序列,没有发生无义突变。转染COS-7细胞后,利用Western blot方法检测到F蛋白的特异性条带,纯度达99%以上。结论初步建立了真核表达RSVF蛋白的纯化方法,为进一步优化RSVF蛋白制备条件及单克隆抗体及诊断试剂等研究奠定了基础。

摘要：目的构建并筛选出具有干扰作用的髓磷脂相关抑制物66(neurite outgrowth inhibitory 66,nogo66)小分子干扰RNA(samll interfering RNA,siRNA)真核表达载体,为进一步构建腺相关病毒载体奠定基础。方法设计2条针对大鼠nogo66基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)和1条阴性对照序列,插入载体pGenesil-1.1,同时用pGenesil-1.1质粒作为空白对照,得到4种质粒pGenesil-nogo66-siRNA-1、pGenesil-nogo66-siRNA-2、pGenesil-nogo66-siRNA-hk、pGenesil-nogo66-siRNA-kb,对4种质粒进行DNA测序和酶切鉴定;培养大鼠胶质细胞瘤C6细胞,用4种质粒进行转染,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白,检测转染效率;采用RT-PCR和Western blot分别检测nogo基因在mRNA水平和蛋白水平的表达差异,筛选出对nogo66基因具有干扰作用的nogo66-siRNA表达质粒。结果DNA测序显示设计的2种质粒干扰序列正确;KpnⅠ/XhoⅠ双酶切4种质粒均可见800bp及4.3kb条带;4种质粒分别转染C6细胞后培养48h,荧光显微镜下均可见绿色荧光蛋白表达,平均转染效率约为73%。RT-PCR和Western blot检测显示:与未转染细胞相比,转染pGenesil-nogo66-siRNA-1使nogo基因表达下降22%、蛋白表达下降73%,转染pGenesil-no-go66-siRNA-2使nogo基因表达下降28%、蛋白表达下降78%,差异均有统计学意义(P0.05)。结论成功构建并筛选出具有干扰作用的nogo66-siRNA真核表达载体,为深入研究脊髓损伤修复奠定了理论基础。

摘要：目的：建立人凝血因子ⅧｃＤＮＡ体外真核高效表达的体系。方法：将人ＦⅧＢ区大部分缺失（Δａ７６０１６３９）的ＦⅧｃＤＮＡ插入ｐＣＩ真核表达载体、ｐＧＲＥ５．２／ＥＢＶ载体和逆转录病毒载体ｐＭＳＣＶ，构建了５种表达框架，在体外转染和感染了多种靶细胞。结果：ｐＣＩⅧ在ＮＩＨ３Ｔ３细胞产生了低水平表达，而ｐＧＲＥ５．２／ＥＢＶⅧ和ｐＭＳＣＶⅧ系列分别在Ｈｅｌａ细胞和Ｂｏｓｃ２３逆转录病毒包装细胞中呈较高水平的表达。Ｂｏｓｃ２３细胞培养上清感染的ＮＩＨ３Ｔ３和３２ＤＣ不能有效地产生ＦⅧ。结论：在ＦⅧ体外表达及基因治疗的方案设计中，靶细胞的选择是一重要因素。

摘要：虎纹捕鸟蛛毒素-XI(HWTX-XI)是从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离的含55个氨基酸残基的蛋白质,兼有胰蛋白酶抑制活性和电压门控钾离子通道抑制活性。通过突变HWTX-XI上的钾离子通道抑制活性关键氨基酸残基设计了2个突变体(分别突变以下氨基酸残基:R5I,R10T,R25A和R5I,R25A),利用pVT102U/α表达载体在酿酒酵母S78中成功表达并获得了高纯度的重组蛋白质;通过分光光度计比色法、膜片钳技术和小鼠脑室注射分别比较三者的胰蛋白酶和钾通道抑制活性以及动物毒性,结果显示:HWTX-XI突变体与HWTX-XI有相同胰蛋白酶抑制活性,但其钾通道活性降低约30倍;小鼠脑室注射HWTX-XI的半致死剂量为247.3μg/kg体重,而突变体在剂量达到25 mg/kg时仍未见明显毒性反应。获得了胰蛋白酶抑制活性保留,但钾通道抑制活性和动物毒性大大降低的突变体,为HWTX-XI胰蛋白酶抑制活性的应用奠定了基础。

摘要：目的对猪囊尾蚴排泄分泌抗原中差异表达蛋白富含亮氨酸重复序列结构域15(leucine-rich repeat containing15,LRRC15)进行真核表达,并预测其抗原表位。方法通过在线软件ExPASy-Port Param和Protean软件预测LRRC15蛋白分子质量、稳定性、氨基酸序列组成及等电点和T淋巴细胞抗原表位。采用基于PCR的精确合成(PCR-based accuratesynthesis,PAS)技术设计全长拼接引物,合成LRRC15基因。构建重组质粒pcDNA3.4-LRRC15并转染至人胚胎肾细胞HEK293,表达LRRC15蛋白,并进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)和免疫印迹试验(Western blotting)鉴定。结果成功构建了重组质粒pcDNA3.4-LRRC15,表达分子质量约70 kDa的LRRC15目的蛋白。经ExPASy-Port Param软件预测,LRRC15属于亲水性蛋白,由644个氨基酸组成,分子质量为69.89 kDa,等电点为5.6;蛋白分子式为C_(3073)H_(4942)N_(846)O_(953)S_(28),不稳定系数为50.3,为一种不稳定蛋白。采用Protean软件预测发现,LRRC15蛋白位于292~295、353~361、521~526、555~564位氨基酸区段具有T细胞抗原表位优势,具有亲水性高、柔韧性好、表面可及性大、抗原性指数高的表位位于122~131、216~233、249~254、333~343、358~361、368~372、384~386、407~412、445~450、469~481、553~564、588~594、607~617、624~639位氨基酸区段。将重组质粒pc DNA3.4-LRRC15转染至HEK293细胞后,SDS-PAGE和Western blotting分析发现,在细胞分泌培养基、细胞裂解上清和沉淀中检测到LRRC15蛋白。从细胞培养基中纯化出LRRC15-His融合蛋白,SDS-PAGE显示在分子质量约为70 kDa处出现明显条带,Western blotting能够识别LRRC15重组蛋白条带。结论成功对猪囊尾蚴排泄分泌抗原中的LRRC15蛋白进行真核表达,并对其抗原表位进行了生物信息学预测,为进一步了解该蛋白的生物学功能奠定了基础。

摘要：以东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch,BmK)BmαTX14全长cDNA序列设计引物,克隆BmαTX14成熟肽,插入毕赤酵母表达载体pPIC9K中,转化酵母,诱导表达。Tricine-SDS-PAGE和Westernblot分析显示,表达产物以可溶性分子形式存在于培养上清中,诱导84h时的表达量达到高峰,约为120mgL。通过Ni金属螯合层析柱亲和层析、聚乙二醇沉淀、凝胶分子筛层析获得纯化的rBmαTX14融合蛋白,经毒性实验表明,具有明显的抗昆虫活性。同时以蝎基因组总DNA为模板进行PCR扩增,得到BmαTX14基因克隆,序列分析显示:BmαTX14在编码信号肽的基因序列中有1个长408bp的内含子,其基因组织结构具有α型Na+通道毒素的特征。从功能活性和基因组织结构两个角度证实BmαTX14为α型Na+通道毒素。

摘要：目的真核细胞表达丙型肝炎病毒(HCV)河北株E2蛋白胞外核心区(E2c)并利用E2c蛋白检测HCV患者血清中特异性抗E2蛋白抗体水平。方法以HCV1b型(河北株)基因序列为基础,设计HCV1b E2c基因序列并通过基因拼接的方法合成;将含有组织型纤溶酶原激活物(t PA)信号肽的E2c扩增产物克隆入p CI-neo真核表达载体,获得p CI-tpa-1b E2c载体;将p CI-tpa-1b E2c真核表达载体转染HEK293T细胞,收集细胞上清后进行浓缩及纯化,Western blot法鉴定蛋白特异性;以获得E2c蛋白为抗原,建立基于雪花莲凝集素(GNA)的改良ELISA检测HCV患者血清特异性抗E2c抗体水平。结果成功利用真核表达系统表达获得E2c蛋白,建立了GNA改良ELISA检测HCV患者血清中抗E2蛋白抗体的方法。结论成功在HEK293T细胞表达HCV-1b E2c蛋白并进行了临床应用。